真核系统中环状多核糖核苷酸的产生技术方案

本披露总体上涉及用于产生

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真核系统中环状多核糖核苷酸的产生
优先权申请的引用
[0001]根据专利合作条约提交的本国际专利申请要求
2021
年5月
17
日提交的美国临时专利申请序列号
63/189,619
和
2021
年3月
26
日提交的美国临时专利申请序列号
63/166,467
的权益
。
序列表
[0002]本申请包含序列表，该序列表已以
ASCII
格式电子提交，并通过引用以其全文特此并入
。
所述
ASCII
副本创建于
2022
年3月
23
日，名为
VL70004WO1_ST25
，并且大小为
316,185
字节
。
通过引用以其全文并入本文的还有在美国临时专利申请序列号
63/189,610
中提交的序列表，该序列表创建于
2021
年5月
17
日，名为
51484
‑
005001_Sequence Listing_5_17_21_ST25
，并且大小为
300,429
字节
。
通过引用以其全文并入本文的还有在美国临时专利申请序列号
63/166,467
中提交的序列表，该序列表创建于
2021
年3月
25
日，名为
51484
‑
003001_Sequence_Listing_3.25.21_ST25
，并且大小为
166,651
字节
。

技术介绍

[0003]环状多核糖核苷酸是多核糖核苷酸的一个亚类，以连续环的形式存在
。
内源性环状多核糖核苷酸在人体组织和细胞中普遍表达
。
大多数内源性环状多核糖核苷酸是通过反向剪接
(backsplicing)
产生的，并且主要发挥非编码作用
。
已提出将合成的环状多核糖核苷酸
(
包括编码蛋白质的环状多核糖核苷酸
)
用于各种治疗性应用和工程应用
。
需要产生
、
纯化
、
和使用环状多核糖核苷酸的方法
。

技术实现思路

[0004]本披露提供了用于产生
、
纯化
、
和使用环状
RNA
的组合物和方法
。
[0005]在第一方面，本披露的特点在于用于使多核糖核苷酸环化的真核系统，该真核系统包含：
(a)
多核糖核苷酸
(
例如，线性多核糖核苷酸
)
，该多核糖核苷酸具有式
5'
‑
(A)
‑
(B)
‑
(C)
‑
(D)
‑
(E)
‑
3'
，其中：
(A)
包含
5'
自切割核酶；
(B)
包含
5'
退火区；
(C)
包含多核糖核苷酸负载物
(cargo)
；
(D)
包含
3'
退火区；并且
(E)
包含
3'
自切割核酶；以及
(b)
包含
RNA
连接酶的真核细胞
。
该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件
(A)、(B)、(C)、(D)
和
(E)
中的任一者之外或之间的另外的元件
。
例如，元件
(A)、(B)、(C)、(D)
和
/
或
(E)
中的任一者可以通过间隔子序列隔开，如本文所述
。
[0006]在另一方面，本披露提供了一种用于使多核糖核苷酸环化的真核系统，该真核系统包含：
(a)
多核糖核苷酸
(
例如，线性多核糖核苷酸
)
，该多核糖核苷酸包括以
5'
至
3'
方向可操作地连接的
(A)、(B)、(C)、(D)
和
(E)
：
(A)5'
自切割核酶；
(B)5'
退火区；
(C)
多核糖核苷酸负载物；
(D)3'
退火区；和
(E)3'
自切割核酶；以及
(b)
包含
RNA
连接酶的真核细胞
。
该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件
(A)、(B)、(C)、(D)
和
(E)
中的任一者之外或之间的另外的元件
。
例如，元件
(A)、(B)、(C)、(D)
和
/
或
(E)
中的任一者可以通过间隔子序列隔开，如本文所述
。
[0007]在另一方面，本披露提供了一种产生环状
RNA
的方法，该方法包括在真核细胞中使
(a)
与
(b)
接触：
(a)
多核糖核苷酸
(
例如，线性多核糖核苷酸
)
，该多核糖核苷酸具有式
5'
‑
(A)
‑
(B)
‑
(C)
‑
(D)
‑
(E)
‑
3'
，其中：
(A)
包含
5'
自切割核酶；
(B)
包含
5'
退火区；
(C)
包含多核糖核苷酸负载物；
(D)
包含
3'
退火区；并且
(E)
包含
3'
自切割核酶；以及
(b)RNA
连接酶
。
在一些实施例中，该
5'
自切割核酶的切割和该
3'
自切割核酶的切割产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸
。
在一些实施例中，该
RNA
连接酶连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的
5'
端和
3'
端，从而产生环状
RNA。
在一些实施例中，将该环状
RNA
从真核细胞分离
。
在一些实施例中，该
RNA
连接酶对于该真核细胞是内源的
。
在一些实施例中，该
RNA
连接酶对于该真核细胞是异源的
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于使多核糖核苷酸环化的真核系统，该真核系统包含真核细胞，该真核细胞包含：
(a)
线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸具有式
5'
‑
(A)
‑
(B)
‑
(C)
‑
(D)
‑
(E)
‑
3'
，其中元件
(A)、(B)、(C)、(D)、
和
(E)
可操作地连接，并且其中：
(A)
包含
5'
自切割核酶；
(B)
包含含有
5'
互补区的
5'
退火区；
(C)
包含多核糖核苷酸负载物；
(D)
包含含有
3'
互补区的
3'
退火区；并且
(E)
包含
3'
自切割核酶；其中该
5'
互补区和该
3'
互补区具有低于
‑
5kcal/mol
的结合自由能，并且
/
或者其中该
5'
互补区和该
3'
互补区具有至少
10℃
的结合
Tm
；以及
(b)RNA
连接酶；其中该
5'
自切割核酶的切割在该线性多核糖核苷酸的
5'
端上产生游离的
5'
‑
羟基基团，并且其中该
3'
自切割核酶的切割在该线性多核糖核苷酸的
3'
端上产生游离的
2',3'
‑
环磷酸基团，得到连接酶相容的线性多核糖核苷酸；并且其中该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的
5'
和
3'
端通过该
RNA
连接酶连接，从而产生环状多核糖核苷酸
。2.
如权利要求1所述的真核系统，其中该
5'
自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶
、
发夹状核酶
、
丁型肝炎病毒核酶
(HDV)、Varkud
卫星
(VS)
核酶
、glmS
核酶
、
扭转核酶
、
扭转姐妹核酶
、
斧头核酶
、
和手枪核酶
。3.
如权利要求1所述的真核系统，其中该
3'
自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶
、
发夹状核酶
、
丁型肝炎病毒核酶
(HDV)、Varkud
卫星
(VS)
核酶
、glmS
核酶
、
扭转核酶
、
扭转姐妹核酶
、
斧头核酶
、
和手枪核酶
。4.
如权利要求1所述的真核系统，其中该5’
互补区具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸并且该3’
互补区具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸
。5.
如权利要求1所述的真核系统，其中该5’
互补区和该3’
互补区具有在
50
％与
100
％之间的序列互补性，并且任选地其中该
5'
互补区和该
3'
互补区包括在它们之间的不多于
10
个错配
。6.
如权利要求1所述的真核系统，其中该
5'
退火区进一步包含具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸并且位于该
5'
互补区的
5'
的
5'
非互补区；并且其中该
3'
退火区进一步包含具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸并且位于该
3'
互补区的
3'
的
3'
非互补区；并且其中：
(a)
该5’
非互补区和该3’
非互补区具有在0％与
50
％之间的序列互补性；并且
/
或者
(b)
该
5'
非互补区和该
3'
非互补区具有大于
‑
5kcal/mol
的结合自由能；并且
/
或者
(c)
该
5'
非互补区和该
3'
非互补区具有低于
10℃
的结合
Tm。7.
如权利要求1所述的真核系统，其中该
3'
退火区和该
5'
退火区促进该线性多核糖核苷酸的
3'
和
5'
端的缔合
。8.
如权利要求1所述的真核系统，其中该
RNA
连接酶是
tRNA
连接酶，任选地其中该
tRNA
连接酶是
(a)
选自由以下组成的组的连接酶：
T4
连接酶
、RtcB
连接酶
、TRL
‑1连接酶
、
和
Rnl1
连接酶
、Rnl2
连接酶
、LIG1
连接酶
、LIG2
连接酶
、PNK/PNL
连接酶
、PF0027
连接酶
、thpR ligT
连接酶
、
和
ytlPor
连接酶；或
(b)
选自由以下组成的组的连接酶：植物
RNA
连接酶
、
叶绿体
RNA
连接酶
、
来自古细菌的
RNA
连接酶
、
细菌
RNA
连接酶
、
真核
RNA
连接酶
、
病毒
RNA
连接酶
、
和线粒体
RNA
连接酶
。9.
如权利要求1所述的真核系统，其中该多核糖核苷酸负载物包含：
(a)
至少一个编码多肽的编码序列；或
(b)
至少一个非编码序列；或
(c)
至少一个编码多肽的编码序列和至少一个非编码序列的组合
。10.
如权利要求1所述的真核系统，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽包含在脊椎动物
、
无脊椎动物
、
植物或微生物的基因组中编码的氨基酸序列，并且
/
或者其中该多肽包含治疗性多肽
、
植物修饰多肽
、
或农业多肽；并且任选地，其中该编码序列经密码子优化用于在受试者中表达
。11.
如权利要求1所述的真核系统，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且进一步包含选自由以下组成的组的额外的元件：
(a)
内部核糖体进入位点
(IRES)
或5’
UTR
序列，其位于该编码序列的
5'
并与之可操作地连接，任选地在该
IRES
或
5'UTR
序列与该编码序列之间具有插入核糖核苷酸；
(b)3
’
UTR
序列，其位于该编码序列的
3'
并与之可操作地连接，任选地在该
3'UTR
与该编码序列之间具有插入核糖核苷酸；以及
(c)(a)
和
(b)
两者
。12.
如权利要求1所述的真核系统，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个非编码序列，并且其中该至少一个非编码
RNA
序列包含：
(a)
至少一个选自由以下组成的组的
RNA
：
RNA
适配体
、
长非编码
RNA(lncRNA)、
转移
RNA
衍生的片段
(tRF)、
转移
RNA(tRNA)、
核糖体
RNA(rRNA)、
小核
RNA(snRNA)、
小核仁
RNA(snoRNA)、
和
Piwi
相互作用
RNA(piRNA)
；或这些
RNA
中的任一者的片段；和
/
或
(b)
至少一个选自由以下组成的组的
RNA
：小干扰
RNA(siRNA)
或其前体
、
双链
RNA(dsRNA)
或至少部分双链
RNA
；发夹
RNA(hpRNA)、
微小
RNA(miRNA)、
或其前体；相位小干扰
RNA(phasiRNA)
或其前体；异染色质小干扰
RNA(hcsiRNA)
或其前体；以及天然反义短干扰
RNA(natsiRNA)
或其前体；和
/
或
(c)
指导
RNA(gRNA)
或其前体；和
/
或
(d)
核酶或核糖开关
。13.
如权利要求1所述的真核系统，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个非编码序列，并且其中该至少一个非编码
RNA
序列包含反式调节靶序列的调节
RNA
，任选地其中该靶序列包含受试基因组的基因的核苷酸序列，并且其中该靶序列的调节是
(a)
该靶序列的表达的上调
、
或
(b)
该靶序列的表达的下调
、
或
(c)
该靶序列的可诱导表达
。14.
如权利要求1所述的真核系统，其中该连接酶：
(a)
对于该真核细胞是内源的，或
(b)
对于该真核细胞是异源的
。15.
如权利要求1所述的真核系统，其中通过以下向该真核细胞提供该线性多核苷酸：
(a)
向该真核细胞提供包含该线性多核苷酸的外源性多核糖核苷酸；
(b)
在该真核细胞中转录向该真核细胞瞬时提供的外源性重组
DNA
分子，该外源性重组
DNA
分子包含编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
并且任选地包含与编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
可操作地连接的异源性启动子；或
(c)
在该真核细胞中转录并入该真核细胞的基因组中的重组
DNA
分子，该重组
DNA
分子包含编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
并且任选地包含与编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
可操作地连接的异源性启动子
。16.
如权利要求1所述的真核系统，其中该真核细胞是：
(a)
单细胞真核细胞，任选地其中该单细胞真核细胞选自由以下组成的组：单细胞真菌细胞
、
卵菌细胞
、
单细胞动物细胞
、
单细胞植物细胞
、
单细胞藻类细胞
、
原生生物细胞
、
和原生动物细胞；
(b)
多细胞真核生物的细胞，任选地其中该多细胞真核生物选自由以下组成的组：脊椎动物
、
无脊椎动物
、
多细胞真菌
、
多细胞卵菌
、
多细胞藻类
、
和多细胞植物
。17.
一种配制品，该配制品包含如权利要求1所述的真核系统，任选地其中该配制品是药物配制品
、
兽用配制品
、
或农业配制品
。18.
一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸通过如权利要求1所述的真核系统产生，任选地其中该环状多核糖核苷酸经纯化
。19.
一种配制品，该配制品包含如权利要求
18
所述的环状多核糖核苷酸，任选地其中该配制品是药物配制品
、
兽用配制品
、
或农业配制品
。20.
一种产生环状
RNA
的方法，该方法包括：
(a)
在真核细胞中使
(i)
与
(ii)
接触：
(i)
线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸具有式
5'
‑
(A)
‑
(B)
‑
(C)
‑
(D)
‑
(E)
‑
3'
，其中元件
(A)、(B)、(C)、(D)、
和
(E)
可操作地连接，并且其中：
(A)
包含
5'
自切割核酶；
(B)
包含含有
5'
互补区的
5'
退火区；
(C)
包含多核糖核苷酸负载物；
(D)
包含含有
3'
互补区的
3'
退火区；并且
(E)
包含
3'
自切割核酶；其中该
5'
互补区和该
3'
互补区具有低于
‑
5kcal/mol
的结合自由能，并且
/
或者其中该
5'
互补区和该
3'
互补区具有至少
10℃
的结合
Tm
；其中该
5'
自切割核酶的切割在该线性多核糖核苷酸的
5'
端上产生游离的
5'
‑
羟基基团，并且其中该
3'
自切割核酶的切割在该线性多核糖核苷酸的
3'
端上产生游离的
2',3'
‑
环磷酸基团，得到连接酶相容的线性多核糖核苷酸；和
(ii)RNA
连接酶；由此该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的
5'
和
3'
端通过该
RNA
连接酶连接，从而产生环状多核糖核苷酸；以及
(b)
任选地，纯化该环状多核糖核苷酸
。21.
如权利要求
20
所述的方法，其中通过以下向该真核细胞提供该线性多核苷酸：
(a)
向该真核细胞提供包含该线性多核苷酸的外源性多核糖核苷酸；
(b)
在该真核细胞中转录向该真核细胞瞬时提供的外源性重组
DNA
分子，该外源性重组
DNA
分子包含编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
并且任选地包含与编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
可操作地连接的异源性启动子；或
(c)
在该真核细胞中转录并入该真核细胞的基因组中的重组
DNA
分子，该重组
DNA
分子包含编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
并且任选地包含与编码该线性多核糖核苷酸的
DNA
可操作地连接的异源性启动子
。22.
如权利要求
20
所述的方法，其中该
5'
自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶
、
发夹状核酶
、
丁型肝炎病毒核酶
(HDV)、Varkud
卫星
(VS)
核酶
、glmS
核酶
、
扭转核酶
、
扭转姐妹核酶
、
斧头核酶
、
和手枪核酶
。23.
如权利要求
20
所述的方法，其中该
3'
自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶
、
发夹状核酶
、
丁型肝炎病毒核酶
(HDV)、Varkud
卫星
(VS)
核酶
、glmS
核酶
、
扭转核酶
、
扭转姐妹核酶
、
斧头核酶
、
和手枪核酶
。24.
如权利要求
20
所述的方法，其中该5’
互补区具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸并且该3’
互补区具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸
。25.
如权利要求
20
所述的方法，其中该5’
互补区和该3’
互补区具有在
50
％与
100
％之间的序列互补性，并且任选地其中该
5'
互补区和该
3'
互补区包括在它们之间的不多于
10
个错配
。26.
如权利要求
20
所述的方法，其中该
5'
退火区进一步包含具有在5与
50
个之间的核糖核苷酸并...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴里，
申请(专利权)人：旗舰创业创新七公司，
类型：发明
国别省市：