一种外泌体中制造技术

本发明专利技术公开了一种外泌体中

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体中ecDNA的分离方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种外泌体中
ecDNA
的分离方法及试剂盒
。

技术介绍

[0002]外泌体
(exosome)
是一种
30
‑
150nm
大小
、
极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞
‑
融合
‑
外排”等一系列调控过程而形成
。
几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态
。
[0003]ecDNA(
染色体外
DNA)
是近期肿瘤学领域的研究热点，国内外的相关研究还处于起步阶段
。ecDNA
指的是从染色体上脱落，脱离染色体以环状结构存在的
DNA。
研究表明
ecDNA
普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并可能与肿瘤的耐药相关
。
目前关于
ecDNA
的研究较少，结合外泌体和
ecDNA
的研究更少，没有相关的专利文献发表出来
。
[0004]目前，可查询的文献报道目前关于
ecDNA
提取的方法主要是采用氯化铯梯度离心法进行提取
。r/>氯化铯梯度离心法亦称平衡密度梯度离心法，用超速离心机对小分子物质溶液长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度
。
溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物
。
经过高速离心后
DNA、RNA
等物质会形成一个连续的浓度梯度，
ecDNA
会悬浮于某一层，进而可以收集纯化获得较高纯度的
ecDNA。
[0005]氯化铯梯度离心法有诸多缺点：
1)
实验过程中使用氯化铯以及溴化乙锭均为有毒试剂，对操作人员身体和环境可能造成危害
。2)
离心次数较多，需用到超速离心机，且必须在专业人士培训后方可进行操作
。3)
实验操作比较复杂，
ecDNA
分层吸取技术较难
。4)
实验时间过长
。5)
无法自动化
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是，提供一种外泌体中
ecDNA
的分离方法及试剂盒
。
主要解决现有技术中氯化铯梯度离心法提取
ecDNA
存在操作复杂
、
成本高
、
效率低的问题
。
[0007]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0008]一种外泌体中
ecDNA
的分离方法，该方法包括：
[0009]对纯化后的外泌体采用裂解液进行裂解，然后采用洗涤液Ⅱ处理，所述洗涤液Ⅱ包括浓度为1‑
6M
的
NaAc、pH
为
5.0
‑
8.0。
[0010]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅱ还包括
NaCl
，
NaCl
的浓度为0‑
6M。
[0011]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅱ中的
NaAc
浓度为4‑
5M。
[0012]作为优选实施方案，所述裂解液的组成为质量百分比1‑
10
％的聚多卡醇，优选为5％的聚多卡醇
。
[0013]作为优选实施方案，所述外泌体的纯化采用磁珠悬液和洗涤液Ⅰ，所述磁珠悬液含有
0.01
‑
1mg/ml
的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠表面包被有能够特异性结合外泌体的抗体；所述洗涤液Ⅰ的组成为
0.1
‑
30mmol/L
的
KH2PO4和
0.3
‑
28mmol/L
的
Na2HPO4。
[0014]作为优选实施方案，所述磁珠悬液含有
0.5mg/ml
的硅羟基磁珠，所述洗涤液Ⅰ的组成为
1mmol/L
的
KH2PO4和
4mmol/L
的
Na2HPO4。
[0015]作为优选实施方案，所述裂解液对外泌体进行裂解后，震荡离心，取上清；然后加入洗涤液Ⅱ，震荡混匀，离心，弃上清
。
[0016]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅱ处理后加入洗涤液Ⅲ，震荡混匀，离心，弃上清；所述洗涤液Ⅲ的组成为5‑
20mmol/L
的
Tris
‑
HCL、0.1
‑
5mg/mL
的蛋白酶
K、0.1
‑
5mg/mL
的羟基磁珠
、
体积比为
20
％
‑
90
％的乙醇
。
[0017]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅲ中乙醇的体积比为
50
％
‑
70
％
。
[0018]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅲ的组成为
10mmol/L
的
Tris
‑
HCL、0.5mg/mL
的蛋白酶
K、1mg/mL
的羟基磁珠
、
体积比为
50
％的乙醇
。
[0019]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅲ处理后加入洗涤液Ⅳ，震荡混匀，离心，弃上清；所述洗涤液Ⅳ的组成为体积比
50
％
‑
90
％的乙醇，优选为
70
％的乙醇
。
[0020]作为优选实施方案，所述洗涤液Ⅳ处理后加入洗脱液，所述洗脱液的组成为5‑
20mmol/L
的
Tris
‑
HCL
，优选为
10mmol/L
的
Tris
‑
HCL。
[0021]本专利技术还提供一种用于分离外泌体中
ecDNA
的试剂盒，所述试剂盒包括磁珠悬液
、
洗涤液Ⅰ、
裂解液
、
洗涤液Ⅱ、
洗涤液Ⅲ、
洗涤液Ⅳ、
洗脱液；
[0022]所述磁珠悬液含有
0.01
‑
1mg/ml
的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠表面包被有能够特异性结合外泌体的抗体；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种外泌体中
ecDNA
的分离方法，该方法包括：对纯化后的外泌体采用裂解液进行裂解，然后采用洗涤液Ⅱ处理，所述洗涤液Ⅱ包括浓度为1‑
6M
的
NaAc、pH
为
5.0
‑
8.0。2.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述洗涤液Ⅱ还包括
NaCl
，
NaCl
的浓度为0‑
6M。3.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述洗涤液Ⅱ中的
NaAc
浓度为4‑
5M。4.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述裂解液的组成为质量百分比1‑
10
％的聚多卡醇，优选为5％的聚多卡醇
。5.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述外泌体的纯化采用磁珠悬液和洗涤液Ⅰ，所述磁珠悬液含有
0.01
‑
1mg/ml
的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠表面包被有能够特异性结合外泌体的抗体；所述洗涤液Ⅰ的组成为
0.1
‑
30mmol/L
的
KH2PO4和
0.3
‑
28mmol/L
的
Na2HPO4。6.
根据权利要求5所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述磁珠悬液含有
0.5mg/ml
的硅羟基磁珠，所述洗涤液Ⅰ的组成为
1mmol/L
的
KH2PO4和
4mmol/L
的
Na2HPO4。7.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述裂解液对外泌体进行裂解后，震荡离心，取上清；然后加入洗涤液Ⅱ，震荡混匀，离心，弃上清
。8.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述洗涤液Ⅱ处理后加入洗涤液Ⅲ，震荡混匀，离心，弃上清；所述洗涤液Ⅲ的组成为5‑
20mmol/L
的
Tris
‑
HCL、0.1
‑
5mg/mL
的蛋白酶
K、0.1
‑
5mg/mL
的羟基磁珠
、
体积比为
20
％
‑
90
％的乙醇
。9.
根据权利要求8所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述乙醇的体积比为
50
％
‑
70
％
。10.
根据权利要求8所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述洗涤液Ⅲ的组成为
10mmol/L
的
Tris
‑
HCL、0.5mg/mL
的蛋白酶
K、1mg/mL
的羟基磁珠
、
体积比为
50
％的乙醇
。11.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述洗涤液Ⅲ处理后加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：马跃，赵小玉，蔡瑶，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：