一种基于制造技术

本发明专利技术属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12a的HPV检测方法及应用


：
[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，尤其涉及一种基于
CRISPR/Cas12a
的高危型
HPV
检测方法及应用
。

技术介绍

：
[0002]宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在我国女性恶性肿瘤中居第二位，位于乳腺癌之后
。
高危型人乳头瘤病毒
(High risk HPV,HR
‑
HPV)
持续感染是引发宫颈癌癌前病变以及宫颈癌的主要危险因素
。
因此，研究建立快速
、
高灵敏
、
高特异的高危型
HPV
检测方法，对于宫颈癌进行早期诊断和风险评估具有重要意义
。
[0003]2021
年第二版
《
宫颈癌前病变筛查和治疗指南
》
中明确提出推荐将
HPV
‑
DNA
检测作为首选的筛查方式，而不是目前的醋酸染色目视观察或细胞学检查
。
实时荧光定量
PCR(RT
‑
PCR)
是目前国内外
HPV DNA
检测使用最为广泛的方法
。
但是，在实际应用中，该方法表现出其局限性，比如检测
Ct
阈值窄，存在灰度区间
(37<Ct<40)
，准确性差，需要昂贵仪器设备和专业操作人员，不适合基层以及现场应用等
。
[0004]CRISPR(Clustered regularly interspaced palindromic repeat)
即成簇的
、
规律间隔的短回文重复序列，是存在于大部分细菌和古细菌中的获得性免疫系统
。
该系统能够通过其转录出的
crRNA(CRISPR RNA)
及
CRISPR
相关蛋白
(CRISPR
‑
associated
，
Cas)
对外来特定核酸实施高特异性干扰
。CRISPR
‑
Cas12a
通过一段
crRNA
与目标核酸碱基互补配对识别，引导
Cas12a
蛋白对目标核酸
DNA
进行特异性地结合和切割之后，激活其非特异核酸酶活性
(
即附属切割活性
)。
基于此原理，
CRISPR/Cas12a
被开发为新型核酸检测和信号放大技术
。MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification,MIRA)
是一种我国自主知识产权的多酶恒温快速扩增技术，与
CRISPR/Cas12a
方法联用，可进一步提高检测灵敏度
。

技术实现思路

：
[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服当前人乳头瘤病毒检测技术的不足和缺陷，研究筛选发现了一套基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
的高危型
HPV
核酸高效检测靶点，针对该靶点利用
CRISPR/Cas12a
系统可实现高灵敏
、
高特异
、
可视化以及精准基因分型检测
。
[0006]本专利技术提供的技术方案之一，是一种基于
CRISPR/Cas12a
系统的高危型
HPV
核酸检测靶点；
[0007]所述高危型
HPV
涉及
14
种不同的
HPV
，分别为：
HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68
；
[0008]针对上述
14
种不同
HPV
的核酸检测靶点的序列分别如
SEQ ID NO.1
‑
14
所示
。
[0009]本专利技术提供的技术方案之二，是技术方案一所述核酸检测靶点的应用，特别是在作为
HPV
核酸检测位点方面的应用，更特别的是作为基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
系统的核酸检测位点方面的应用
。
[0010]本专利技术提供的技术方案之三，是一种基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
系统的
HPV
检测方
法，具体是利用
Cas12a
蛋白和对应所述检测靶点的
crRNA
进行
CRISPR/Cas
核酸检测；
[0011]所述
crRNA
的设计原则是：
crRNA
靶向序列5’
端应具备5’‑
TTN
‑3’
序列，
crRNA
序列
(
包括
crRNA
骨架序列
)、crRNA
靶向序列不形成稳定二级结构；
[0012]进一步地，所述
crRNA
的序列如
SEQ ID NO.15
‑
28
任一所示
。
[0013]本专利技术提供的技术方案之四，是一种基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
的
HPV
精准检测系统或试剂盒，包括恒温扩增引物
、Cas12a
蛋白
、crRNA
；
[0014]所述检测系统或试剂盒针对
14
种高危型
HPV
中的任意一种或全部进行检测，分别为：
HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68
；
[0015]所述
Cas12a
蛋白为具有核酸内切酶活性同时具有附属核酸切割活性的
Cas12a
蛋白，例如
LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a、ScCas12a
等；
[0016]所述恒温扩增引物的序列为针对
SEQ ID NO.1
‑
14
所示
HPV
检测靶点中的任意一种或多种的满足本专利技术扩增引物设计原则的扩增引物，优选序列
SEQ ID NO.29
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高危型
HPV
核酸检测靶点，其特征在于，所述高危型
HPV
涉及
14
种不同型别的
HPV
，分别为：
HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68
；针对上述
14
种不同型别
HPV
的核酸检测靶点的序列，分别如
SEQ ID NO.1
‑
14
所示
。2.
权利要求1所述
HPV
核酸检测靶点在
HPV
检测中的应用
。3.
一种基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
系统的
HPV
检测方法，其特征在于，是利用
Cas12a
蛋白和特异性的
crRNA
和对应所述检测靶点进行
CRISPR/Cas
核酸检测；所述
crRNA
的序列，如
SEQ ID NO.15
‑
28
任一所示
。4.
一种基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
的
HPV
检测系统或试剂盒，其特征在于，包括恒温扩增引物
、Cas12a
蛋白
、crRNA
；所述检测系统或试剂盒还包含恒温扩增试剂
、NEBuffer 2.1
缓冲液
、
修饰有荧光基团和淬灭基团的单链
DNA
报告分子
。5.
如权利要求4所述的一种基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
的
HPV
检测系统或试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增引物的序列为针对
SEQ ID NO.1
‑
14
所示
HPV
检测靶点中的任意一种或多种的扩增引物，序列如
SEQ ID NO.29
‑
56
中的一对或多对所示；所述
crRNA
的序列为针对
SEQ ID NO.1
‑
14
所示
HPV
检测靶点中的任意一种或多种的
crRNA
序列，序列
SEQ NO.15
‑
28
中的一条或多条所示
。6.
如权利要求4所述的一种基于
MIRA
‑
CRISPR/Cas12a
的
HPV
检测系统或试剂盒，其特征在于，所述
Cas12a
蛋白为具有核酸内切酶活性同时具有附属核酸切割活性的
Cas12a
蛋白，包括
LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a、ScCas12a
等；所述恒温扩增试剂组成为：
Tris
‑
HCl
缓冲液
(pH8.0)20
‑
300mM、
氯化钠
10
‑
100mM、
氯化钾
10
‑
100mM、
氯化镁5‑
50mM、
二硫苏糖醇2‑
20mM、
聚乙烯吡咯烷酮5％
‑
30
％
、ATP 2
‑
50mM、dNTPs 2
‑
20mM、
磷酸烯醇丙酮酸2‑
30mM、
丙酮酸激酶
100
‑
1000ng/
μ
L、T4
噬菌体
D...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷利眷，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：