一种用于非洲猪瘟病毒制造技术

一种用于非洲猪瘟病毒

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲猪瘟病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于核酸可视化检测
，具体涉及一种用于非洲猪瘟病毒
LAMP
检测的引物组
、
试剂盒及其应用
。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟
(African swine fever,ASF)
是最具破坏性的出血性传染病之一，由于缺乏疫苗和有效的治疗方法，早期快速诊断对疫情的防控起着至关重要的作用
。
其病原体非洲猪瘟病毒
(African swine fever virus,ASFV)
被国际病毒分类委员于
2005
年归属为非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属
。
非洲猪瘟病毒是一种高度传染性的双链
DNA
病毒
。
它的基因组在
170
～
193kbp
范围内，编码
68
种结构蛋白和
100
多种非结构蛋白
。
根据毒力程度，
ASFV
可分为高致病性
、
中等毒力
、
低毒力和无症状感染株
。
在非洲猪瘟临床病例中，高致病性病毒感染最为常见，发病率和死亡率达到
100
％
。
因此，世界动物卫生组织
(WOAH)
将
ASF
列为必须报告的动物流行性疾病，中国也将
ASFr/>列为
I
类动物流行性疾病
。
[0003]根据国家标准表明
ASFV
的实验室检测方法包括各种
ELISA
方法以及如
RCR、Real
‑
time PCR
等核酸检测方法，目前国内外已报道的
ASFV
检测方法主要以核酸检测最为常见
。Real
‑
time PCR
因其高灵敏度和低交叉污染率被
WOAH
推荐为
ASFV
检测方法金标准，这也是目前最为常用的实验室检测方法
。Real
‑
time PCR
方法具有较高的检出限，但其依赖于精准控温的仪器设备和专业的操作，不适应于疫病现场检测
。ELISA
不需要昂贵的仪器和复杂的扩增过程，但其灵敏度相对较低，且需要使用温度敏感的试剂，在环境复杂的地区不易保存，从而会进一步降低灵敏度
。
[0004]综上所述，以上方法由于对操作环境，精密设备以及技术人员的专业性依赖较高，限制了其应用范围，不利于在条件有限的基层地区或疫病现场进行快速诊断和推广使用
。
因此，亟需建立一种快速
、
简便
、
准确
、
成本低的诊断方法，为
ASFV
现地快检
、
病原的监测及疫情预警提供新型的检测技术与物质基础
。

技术实现思路

[0005]为了解决
ASFV
现有检测方法存在的赖于精准控温的仪器设备和专业的操作，不适应于疫病现场检测，灵敏度低等问题，本专利技术提供了灵敏度高
、
特异性强
、
操作简单快速的非洲猪瘟病毒
LAMP
可视化检测引物组合及试剂盒
。
[0006]未解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种用于非洲猪瘟病毒
LAMP
检测的引物组，所述引物组用于检测非洲猪瘟病毒
B646L
基因，引物组由核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.2
所述的内引物对，核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
和
SEQ ID NO.4
所述的外引物对，核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
和
SEQ ID NO.6
所述的环引物对组成
。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述环引物对的
LF
序列5’
端修饰有羧基荧光素；所述环引物对
LB
序列5’
端修饰有生物素
Biotin。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，将上述环引物对应用于胶体金或密闭式核酸检测装置中
。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供上述引物组在制备非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂中的应用
。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供上述引物组在制备非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂盒中的应用
。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2任意一项所述的引物组
。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示的
ASFV B646L
基因全长阳性质粒
。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有
Bst DNA
聚合酶
、LAMP
反应液和甜菜碱
。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述
LAMP
反应液含有
10mM dNTP
，
10
×
Amplification Buffer
重悬缓冲液和
100mM
硫酸镁水溶液
。
[0016]本专利技术的第五个目的是提供一种非洲猪瘟病毒的
LAMP
非诊断目的检测方法，包括以下步骤：
[0017](1)
将待测样品核酸和
B646L
基因全长阳性质粒分别与权利要求1或2所述的引物组
、100mM
硫酸镁水溶液
、10mM dNTP、
甜菜碱
、10
×
Amplification Buffer
重悬缓冲液
、Bst DNA
聚合酶和
DEPC
水充分混匀后离心；
[0018](2)
进行
LAMP
反应，获得
LAMP
扩增产物；
[0019](3)
使用一次性封闭式核酸可视化检测装置对
LAMP
扩增产物进行检测；
[0020](4)
结果判读：若质控线和检测线位置均出现红色条带，则样品中含有非洲猪瘟病毒；若质控线位置出现红色条带，而检测线位置无条带，则样品中不含非洲猪瘟病毒；若质控线位置没有出现红色条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于非洲猪瘟病毒
LAMP
检测的引物组，其特征在于，所述引物组用于检测非洲猪瘟病毒
B646L
基因，由核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
和
SEQ ID NO.2
所述的内引物对，核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
和
SEQ ID NO.4
所述的外引物对，核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
和
SEQ ID NO.6
所述的环引物对组成
。2.
根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述环引物对的
LF
序列5’
端修饰有羧基荧光素；所述环引物对的
LB
序列5’
端修饰有生物素
Biotin。3.
权利要求1或2任意一项所述引物组在制备非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂中的应用
。4.
权利要求1或2任意一项所述引物组在制备非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂盒中的应用
。5.
一种非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2任意一项所述的引物组
。6.
根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒
LAMP
检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示的
ASFV B646L
基因全长阳性质粒
。7.
一种非洲猪瘟病毒的
LAMP
非诊断目的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
将待测样品核酸和
B646L
基因全长阳性质粒分别与权利要求1或2所述的引物组
、100mM
硫酸镁水溶液
、10mM dNTP、
甜菜碱
、10
×
Amplification Buffer
重悬缓冲液
、Bst DNA
聚合酶和
DEPC
水充分混匀后离心；
(2)
进行
LAMP
反应，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄培，刘星岐，刘光亮，谭树义，曹宗喜，王化磊，张梦瑶，张艳，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：