负载至少两个不同核酸的细胞外囊泡制造技术

负载至少两个不同核酸的细胞外囊泡

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】负载至少两个不同核酸的细胞外囊泡
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求
2021
年3月
31
日提交的
63/169161
号美国临时申请的权益，该申请的内容通过引用整体并入本文
。

技术介绍

[0003]核酸疗法代表了能够在基因水平上进行治疗干预的新模式
。
其包括但不限于短
RNA(
如反义寡核苷酸
(ASOs)、
短干扰
RNA(siRNA)
和微小
RNA(miRNA))
，长
RNA(
如信使
RNA(mRNA))
，或甚至双链
DNA(dsDNA)。
这些模式通常被认为是疾病修饰的，因为它们抑制或促进疾病相关蛋白的产生
。
随着
CRISPR
‑
Cas9、
锌指核酸酶
(ZFN)
和转录激活因子样效应物核酸酶
(TALENs)
等基因组编辑工具的发现，现在可以在基因组水平上根本性地纠正疾病
。
然而，核酸作为下一代药物的临床开发受到了阻碍，主要是由于其不能穿透细胞膜
、
具有免疫原性以及易受到循环中核酸酶影响，导致其在递送方面受到限制
。
[0004]目前，大多数核酸治疗都涉及单一靶点，例如已批准的药物，如帕蒂西兰
(Patisiran)(
针对遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性的
siRNA)、
奈
‑
沃瑞替近
(Voretigene neparvovec)(
针对
Leber
先天性黑蒙症的
AAV
基因疗法
)、
或辉瑞
‑
BioNTech COVID19 mRNA
疫苗
。
然而，有几种治疗应用受益于两种或多种基因产物的递送
。
一个此类例子是载体化抗体或抗体基因治疗的概念，其中，在涉及递送编码抗体的重链和轻链的两个转基因的基因治疗之后，抗体从患者的器官
(
如肝脏
)
内源性产生
。
另一个例子是基因组编辑，其需要有效的载体来共同递送其多种成分
。
具体而言，
CRISPR
‑
Cas9
系统介导的基因插入需要
Cas9
的转录物和向导
RNA
，以及同源性定向修复的
DNA
模板
。
引物编辑涉及共同递送编码与工程化逆转录酶融合的
SpCas9
核酸内切酶的转录物以及引物编辑向导
RNA(pegRNA)。
[0005]两种最先进且被广泛探索的递送载体是腺相关病毒
(AAV)
和脂质纳米颗粒
(LNP)。AAV
是一种小型
(20nm)
复制缺陷病毒，能够感染分裂细胞和静止细胞
。
这些病毒被积极用于基因治疗用途，因为与相同剂量的其他病毒相比，它们不会引起疾病，引发的免疫反应也相对温和
。
然而，其受限于较小的转基因容量
(4.5kb)
，并且由于再给药时产生适应性免疫反应而无法再给药
。LNP
是下一类递送载体，其向肝细胞和树突状细胞递送
RNA
的能力已得到临床验证
。
然而，
LNP
在循环中相对不稳定，向肝细胞以外的组织进行全身性核酸递送仍然具有高度挑战性
。
[0006]细胞外囊泡
(EV)
是介导细胞间生物分子的转移的细胞来源的脂质膜结合囊泡
。EV
具有生物相容性，并具有独特的天然嗜性，并且，由于其来源于细胞细胞，它们几乎没有毒性或免疫原性的威胁
。
我们之前已经证明，红细胞
EV(RBCEV)
可以用外源性地负载多种有效载荷，包括
ASO、mRNA
和
DNA(
例如，参见
PCT/SG2021/050020
，其内容完全并入本文
)。
[0007]鉴于以上考虑而设计了本专利技术
。
[0008]概述
[0009]本文提供了负载有负荷物的细胞外囊泡，其中所述负荷物包括至少两个不同的核
酸分子
。
在一些情况下，所述负荷物包括至少三个不同的核酸分子
。
[0010]所述核酸分子可以选自下组：
DNA
质粒
、RNA
质粒
、
环状
DNA、
线性双链
DNA、DNA
微环
、
哑铃形
DNA
最小载体
、RNA
微环
、
小干扰
RNA(siRNA)、
信使
RNA(mRNA)、
向导
RNA(gRNA)、
引物编辑向导
RNA(peg RNA)、CRISPR RNA(crRNA)
，反式激活
CRISPR RNA(tracrRNA)、
环状
RNA、
微小
RNA(miRNA)、
初级
miRNA(pri
‑
miRNA)、
前体
miRNA(pre
‑
miRNA)、piwi
相互作用
RNA(piRNA)、
转移
RNA(tRNA)、
长非编码
RNA(lncRNA)、
反义寡核苷酸
(ASO)、
短发夹
RNA(shRNA)、
小激活
RNA(saRNA)、
小核
RNA(snoRNA)、
缺口聚物
(gapmer)、
锁核酸
(LNA)、
肽核酸
(PNA)
和表达载体
。
[0011]所述至少两个不同的核酸分子或至少三个不同的核酸分子可以具有不相同的序列
。
同时或替代地，所述至少两个不同的核酸分子或至少三个不同的氨基酸可以是不同类型的核酸分子
。
例如，所述负荷物可以包括至少两个不同的分子，其中所述至少两个不同的分子中每一个均独立地选自下组：小干扰
RNA(siRNA)、
信使
RNA(mRNA)、
向导
RNA(gRNA)、
引物编辑向导
RNA(peg RNA)、CRISPR RNA(crRNA)
，反式激活
CRISPR RNA(tracrRNA)、
环状
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种负载有负荷物的细胞外囊泡群，其中所述负荷物包含至少两个不同的核酸分子，并且所述群通过在转染试剂存在下将所述细胞外囊泡与所述负荷物接触来制备
。2.
如权利要求1所述的群，其中所述转染试剂为阳离子脂质试剂
。3.
如权利要求2所述的群
,
其中所述转染试剂选自下组：
Lipofectamine
TM
3000
TM
(
赛默飞世尔
)、Turbofect
TM
(
赛默飞世尔
)、Lipofectamine
TM
MessengerMAX
TM
(
赛默飞世尔
)、Exofect
TM
(
系统生物科学公司
)
和线性聚乙烯亚胺盐酸盐
。4.
如权利要求3所述的群，其中所述转染试剂为平均分子量为
25000Da
或
40000Da
的线性聚乙烯亚胺盐酸盐
。5.
如权利要求4所述的群，其中所述转染试剂为为
PEIMax
TM
(
欣科宝利公司
)
或
(
保利嘉
)。6.
一种负载有负荷物的细胞外囊泡，其中所述负荷物包括至少两个不同的核酸分子
。7.
如权利要求6所述的细胞外囊泡，其中所述至少两个不同的核酸分子具有不相同的序列
。8.
如权利要求6或7所述的细胞外囊泡，其中所述至少两个不同的核酸分子是不同类型的核酸分子
。9.
如权利要求6‑8中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核酸分子选自下组：
DNA
质粒
、RNA
质粒
、DNA
微环
、
哑铃形
DNA
最小载体
、RNA
微环
、
环状
DNA、
线性双链
DNA、
小干扰
RNA(siRNA)、
信使
RNA(mRNA)、
向导
RNA(gRNA)、
引物编辑向导
RNA(peg RNA)、CRISPR RNA(crRNA)
，反式激活
CRISPR RNA(tracrRNA)、
环状
RNA、
微小
RNA(miRNA)、
初级
miRNA(pri
‑
miRNA)、
前体
miRNA(pre
‑
miRNA)、piwi
相互作用
RNA(piRNA)、
转移
RNA(tRNA)、
长非编码
RNA(lncRNA)、
反义寡核苷酸
(ASO)、
短发夹
RNA(shRNA)、
小激活
RNA(saRNA)、
小核
RNA(snoRNA)、
缺口聚物
(gapmer)、
锁核酸
(LNA)、
肽核酸
(PNA)
和表达载体
。10.
前述权利要求中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述负荷物包含：
DNA
和
RNA、
至少两个不同的
mRNA
分子
、
质粒和
gRNA、mRNA
和
gRNA
，质粒和反义寡核苷酸
、
质粒和
siRNA。11.
如权利要求6所述的细胞外囊泡，其中所述负荷物包含
CRISPR/Cas
基因编辑系统的组分
。12.
如权利要求
11
所述的细胞外囊泡，其中所述负荷物包含
gRNA
分子和编码核酸酶的核酸分子，其中优选地所述核酸酶为
Cas9
核酸酶或
Cas12
核酸酶
。13.
如权利要求
12
所述的细胞外囊泡，其中所述
gRNA
是
sgRNA
或
pegRNA。14.
如权利要求
12
或
13
所述的细胞外囊泡，其中所述负荷物进一步包含
DNA
修复模板
。15.
一种细胞外囊泡，其包含编码抗原结合分子或其片段的
mRNA
或质粒
。16.
如权利要求
15
所述的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡包含编码抗原结合分子的第一多肽的第一核酸和编码抗原结合分子的第二多肽的第二核酸
。17.
如权利要求
15
或权利要求
16
所述的细胞外囊泡，其中所述抗原结合分子是抗体或其抗原结合片段
。18.
如权利要求
17
所述的细胞外囊泡，其中所述抗原结合分子是抗体或
scFv。19.
前述权利要求中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡来自红细胞
。20.
一种包含细胞外囊泡的组合物，其中所述组合物中的至少一个细胞外囊泡是如权利要求6至
19
中任一项所述的细胞外囊泡
。
21.
一种使细胞外囊泡负载负荷物的方法，所述方法包括：
a.
提供混合物，所述混合物包含待负载到细胞外囊泡中的负荷物分子；和
b.
在足以使细胞外囊泡负载所述负荷物分子的条件下与所述细胞外囊泡接触；其中所述负荷物分子的混合物包含至少两个不同的核酸分子
。22.
如权利要求
21
所述的方法，其中所述混合物进一步包含转染试剂
。23.
如权利要求
...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：胭脂红治疗私人有限公司，
类型：发明
国别省市：