人制造技术

本发明专利技术属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种人

【技术实现步骤摘要】
No:5
；
[0013]所述
N48K
突变引物对的上游引物序列为
SEQ ID No:6
，其下游引物序列为
SEQ ID No:7
；
[0014]上述突变引物对以
SEQ ID NO:10
所示序列的
IL
‑6基因为扩增模板
。
[0015]本专利技术保护所述的人
IL
‑6突变体在制备亲和层析柱中的应用
。
[0016]进一步的，所述人
IL
‑6突变体作为抗原
。
[0017]本专利技术又保护一种亲和层析柱，用于人
IL
‑6抗体纯化使用，所述亲和层析柱以
sepharose4b
为载体，偶联所述的人
IL
‑6突变体蛋白
。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术提供的人
IL
‑6突变体，通过蛋白构象的改变，降低了其与抗体的亲和性，采用该突变体制备的亲和层析柱在纯化特异性的
IL
‑6抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，变得更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率大大提升
。
[0020]本专利技术通过对
IL
‑6蛋白突变的实验，经过大量筛选，确定了
C
端的
A13D
，
K27R
，
N48K
突变位点能引起
IL
‑6抗原与抗体亲和力的减弱，基于此，制备了
IL
‑6抗原突变体亲和层析柱；该亲和层析柱以
sepharose 4b
为载体，偶联
IL
‑6突变体，可以快速
、
高效的得到高纯度
IL
‑6单克隆抗体
。
附图说明
[0021]图1为
IL
‑6突变体蛋白纯度分析结果图
。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚
、
完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例
。
基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围
。
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂和生物材料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得
。
[0024]实施例
1 IL
‑6基因突变库的构建
[0025]IL
‑6抗原
(
购自上海友科生物科技有限公司，人工合成
)
的氨基酸序列如
SEQ ID No:9
所示；其碱基序列如
SEQ ID No:10
所示
。
[0026]为了解决
IL
‑6抗原
(
氨基酸序列如
SEQ ID No:9
所示，核苷酸序列如
SEQ ID No:10
所示
)
抗体的结合力，通过定向进化技术对该蛋白进行了大量突变的筛选，优化并自行设计3对
PCR
引物：
[0027]1)
用于
A13D
突变引物对：
[0028]上游引物如
SEQ ID No:2
所示，即：5’‑
GGAATTCGGATCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG
‑3’
；
[0029]下游引物如
SEQ ID No:3
所示，即：5’‑
ACGCCTCGAGCTGTCTGTGTGGGTCGGC
‑3’
。
[0030]2)
用于
K27R
突变引物对：
[0031]上游引物如
SEQ ID No:4
所示，即：5’‑
GGAATTCGGATCCAGACAGCCACTCACC
‑3’
；
[0032]下游引物如
SEQ ID No:5
所示，即：5’‑
ACGCCTCGAGGTACCGAATTTGTCTGTC
‑3’
。
[0033]3)
用于
N48K
突变引物对：
[0034]上游引物如
SEQ ID No:6
所示，即：5’‑
GGAATTCGGATCCCGACGGCATCTCAGCCCT
‑3’
；
[0035]下游引物如
SEQ ID No:7
所示，即：5’‑
ACGCCTCGAGTCACATTTGCCGAAGAG
‑3’
。
[0036]实施例
2 IL
‑6突变体表达菌株的构建和发酵
[0037]步骤
1、
以
IL
‑6基因为模板，使用上述引物，加入2×
TransStart FastPfu PCR SuperMix
扩增整个质粒基因
。PCR
反应条件为：
94℃
变性
5min
；然后
94℃
变性
30s
，
60℃
复性
30s
，
72℃
延伸
5min
，
30
个循环后，
72℃
充分延伸
10min
，
4℃
保存
。PCR
结束后加入
DMT
酶消化体外降解非突变型质粒模板，胶回收目的基因
。
[0038]步骤
2、
将胶回收突变体基因和
pET
‑
28a
载体用
BamHI
和
XhoI
酶切后暴露出相同的末端，
T4
连接酶室温连接，转化
DMT
感受态细胞中，涂布
LB+Kan
平板，
37℃
过夜培养
。
次日，筛选得到重组菌株
。
[0039]步骤
3、
从培养平板挑取单克隆菌落接种到
10ml LB+Kan
培养基中，
37℃
培养后，提取质粒，送测序公司检测
。
[0040]步骤
4、
检测成功的质粒转化到
BL21(DE3)
感受态中，涂布
LB+Kan
平板，
37℃
过夜培养
。
挑取单克隆菌落接种到
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种人
IL
‑6突变体，其特征在于，是在氨基酸序列如
SEQ ID No:9
所示的人
IL
‑6抗原的基础上突变得到，突变位点为
A13D、K27R、N48K。2.
根据权利要求1所述的人
IL
‑6突变体，其特征在于，所述人
IL
‑6突变体的氨基酸序列为
SEQ ID No:8。3.
编码权利要求1所述人
IL
‑6突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为
SEQ ID No:1。4.
构建权利要求1所述人
IL
‑6突变体的突变引物对，其特征在于，所述突变引物对包括
A13D
突变引物对
、K27R
突变引物对
、N48K
突变引物对；所述
A13D
突变引物对的上游引物序列为
SEQ ID No:2
，其下游引物序列为
SEQ ID No...

【专利技术属性】
技术研发人员：王硕硕，宁平，孙谧，
申请(专利权)人：青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：