一种成团泛菌突变株及其获取方法和应用技术

本发明专利技术提出一种成团泛菌突变株及其获取方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种成团泛菌突变株及其获取方法和应用


[0001]本专利技术涉及成团泛菌底盘生物
，具体涉及一种成团泛菌突变株及其获取方法
、
应用
。

技术介绍

[0002]在合成生物学应用领域，酿酒酵母和大肠杆菌被作为最重要的底盘生物：酿酒酵母被改造后用于生产各种植物来源的天然产物；相对而言，大肠杆菌被改造用于生产天然产物和抗生素等次生代谢产物的案例较少，合成能力也较弱
。
当前生产抗生素等次生代谢产物主要以链霉菌和霉菌为底盘实现：链霉菌生长慢，发酵周期较长；霉菌发酵难度大，不利于大规模生产
。
成团泛菌
(Pantoea agglomerans)
被归类于肠杆菌科
(Enterobacteriaceae)
泛菌属
(Pantoea)
，文献报道可产生草欧菌素
(herbicolin)
和
andrimid
等极具应用潜力的次生代谢产物，有进一步开发替代大肠杆菌作为原核生物次级代谢产物合成底盘的潜力
。
利用合成生物学方法生产天然产物依赖稳定高效的底盘
、
多样且可用的生物学元器件和可靠的改造方法
。
目前报道的可用于成团泛菌的遗传操作元件不多：
202310424222.5
报道了可用于成团泛菌的质粒，其中包含了可用于在成团泛菌胞内游离复制的质粒复制区及抗生素筛选标签；
CN115820676A
提供了一种基于成团泛菌的基因敲除方案
。
本专利提供了一种成团泛菌突变株
NTU
‑
3W、
该突变株的获得方法及其基因编辑方案
。
该突变株及基因编辑方法的结合使用可用于提供一种原核生物天然产物的合成底盘
。

技术实现思路

[0003]本专利技术利用来源于大肠杆菌和分枝杆菌穿梭质粒
pMV261
和
pMV306
电穿孔导入成团泛菌
NTU
后发现有较小的几率在卡那霉素抗性平板上获得白色抗性菌落
(
菌落形态和其他生长性状几乎相同
)
，该突变株缺少合成
β
‑
胡萝卜素的能力且突变性状能稳定传代
。
进一步抗性谱研究发现该突变菌株丧失了对氨苄青霉素的耐药性，在终浓度为
100
μ
g/mL
的
LB
固体平板上无法生长
。
进一步查阅文献表明该菌株可能丢失了内源质粒
(
如
Pantoea agglomerans
菌株
P10c plasmid pPag3
带有
β
‑
胡萝卜素生物合成基因簇及
β
‑
内酰胺酶基因；
Pantoea agglomerans
菌株
DAPP
‑
PG734
的
P1
质粒则带有
β
‑
胡萝卜素生物合成基因簇
、
氯霉素外排泵基因和氨苄青霉素正调控基因
ampR
，不带有
β
‑
内酰胺酶基因
)。
已知测序的绝大多数成团泛菌都带有内源质粒，胞内带有
β
‑
胡萝卜素生物合成基因簇的内源质粒通常较大
(
如
P1
质粒约为
530kb
，而
pPag3
质粒约为
560kb)。
这些质粒均带有能在细胞内稳定分配的
parA
和
parB
基因，在常规消除质粒的操作中难以去除
。
[0004]具体技术方案包括：
[0005]一种成团泛菌突变株，命名为成团泛菌
(Pantoea agglomerans)NTU
‑
3W
，于
2023
年6月
20
日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为
CGMCC 27665。
[0006]优选的，其突变株性状为：白色
。
[0007]优选的，其突变株性状为：没有胡萝卜素合成基因簇
。
[0008]优选的，其突变株性状为：没有
β
‑
内酰胺酶基因
。
[0009]优选的，其突变株性状为：丢失若干内源质粒
。
[0010]优选的，其突变株性状为：其导入的外源质粒的稳定性提高至
95
％
。
[0011]本专利技术还提供一种成团泛菌突变株获取方法，包括如下步骤：
[0012]制备成团泛菌电转感受态菌悬液；
[0013]向成团泛菌菌悬液中加入质粒，对所得的混合物进行电击处理；
[0014]对经电击处理的菌液进行涂布平板培养，得到白色成团泛菌转化子
。
[0015]优选的，所述质粒为分别来源于大肠杆菌的
pMV261
或分枝杆菌的穿梭质粒
pMV306。
[0016]优选的，将菌体和质粒混合物吸入预冷的电击杯中，设置
BTX ECM830
电转条件为电压
2500V
，波长为
100
μ
S
，电击次数为
12
次，电击间隔
2S。
[0017]本专利技术还提供一种成团泛菌突变株内源质粒消除方法，包括如下步骤：
[0018]将成团泛菌
NTU
和白色突变子转化子分别转接液体
LB
培养基培养；
[0019]将所述培养物涂布于
LB
固体平板，再次培养；
[0020]挑取单菌落分别划线终浓度为
50
μ
g/mL
卡那霉素的
LB
固体平板和
LB
固体平板，培养获得能在
LB
固体平板上生长但在卡那霉素抗性平板上不能生长的单菌落
。
[0021]本专利技术还提供一种上述成团泛菌突变株的应用，可利用所述质粒
(pMV261
或
pMV306)
在成团泛菌中表达外源的基因或基因簇，还可使用所述突变株或突变株进一步结合基因编辑方法改造作为天然产物表达的底盘生物
。
[0022]有益效果：本专利技术所描述的白色突变株可适配归巢核酸酶
I
‑
sceⅠ的基因编辑方案
(Posfai et al.,1999,Nucleic Acids Research
和
Yu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种成团泛菌突变株，其特征在于，命名为成团泛菌
(Pantoea agglomerans)NTU
‑
3W
，于
2023
年6月
20
日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为
CGMCC 27665。2.
根据权利要求1所述的一种成团泛菌突变株，其特征在于，其突变株性状为：白色
。3.
根据权利要求1所述的一种成团泛菌突变株，其特征在于，其突变株性状为：没有胡萝卜素合成基因簇
。4.
根据权利要求1所述的一种成团泛菌突变株，其特征在于，其突变株性状为：没有
β
‑
内酰胺酶基因
。5.
根据权利要求1所述的一种成团泛菌突变株，其特征在于，其突变株性状为：丢失若干内源质粒
。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：路志群，王兆慧，邓自发，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：