产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌异源表达了密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶；所述密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶的编码基因是如

【技术实现步骤摘要】
产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]环氧化物水解酶（
epoxide hydrolase
，
EH
）在自然界中广泛存在
。
一般来说，在哺乳动物
、
昆虫
、
植物（例如：大豆
、
水芹与土豆等）和微生物（例如：酵母
、
细菌和丝状真菌）的体内都可以找到此种酶
。
该酶又称为环氧化物水合酶
。
通过对不同来源的环氧化物水解酶的一级结构进行多序列比对，发现它们具有较高的序列相似性
。
此外，通过分析环氧化物水解酶的三维结构可以发现它们大多数属于
α
/
β
折叠型的水解酶家族
。
进一步的研究表明这些酶呈现三位一体的结构，具有相当保守的催化三联体
。
研究人员根据分子遗传学方法和生物物理手段进一步解析了环氧化物水解酶的精细结构
。EH
包含了核心结构和帽子结构两个功能结构域
。
其中核心结构由8个
β
‑
折叠组装而成，里面包含由1个
His
残基和2个
Asp
残基（其中一个
Asp
残基是亲核性，另一个
Asp
残基是用来传递电子）构成的催化三联体
。
此外，五个螺旋组成帽子功能结构域，人们发现在帽子功能结构域中至少存在着一个起催化功能的酪氨酸残基，它为环氧化物水解酶催化的水解反应提供质子
。
[0003]环氧化物水解酶分为7个亚家族，其中可溶性环氧化物水解酶与微粒体环氧化物水解酶相关的研究较为成熟
。
同时，
EH
所催化的反应并不需辅酶与金属离子，并且具有活性与底物专一性
、
对映体选择性（是酶在对称的外消旋化合物中优先识别一种异构体的能力大小）
、
区域选择性
、
构型逆转与对映会聚等特性
。
该酶在动力学拆分方面具有非常广泛的价值
。Pedragosa
‑
Moreau 等利用来源于 A. niger
（
LCP 521
）的环氧化物水解酶对外消旋香叶醇氨基甲酸酯类进行拆分，得到
e.e.
值为
94%
的
S 构型产物，收率可达
42%。
[0004]已有报道从土壤中分离的芽孢杆菌所产环氧化物水解酶能以苯基缩水甘油醚为水解底物，但枯草芽孢杆菌仍存在表达水平低
、
基因工程改造操作复杂等缺点
。
大肠杆菌表达系统是较早被采用，也是目前掌握的较为成熟的蛋白表达系统
。
大肠杆菌作为用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚
、
易于培养和控制；培养操作简单
、
转化和转导效率高
、
生长繁殖快
、
表达水平高
、
周期短
、
成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统
。
因此，若能将芽孢杆菌环氧化物水解酶采用大肠杆菌表达系统表达出来，将大大提高孢杆菌环氧化物水解酶的生产效率
。

技术实现思路

[0005]（一）要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点
、
不足，本专利技术提供一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌，可利用大肠杆菌表达系统高效
、
低成本地表达芽孢杆菌环氧化物水解酶
。
[0006]（二）技术方案第一方面，本专利技术提供一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌异源表达了密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶；所述密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶的编码基因是如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列
。
[0007]优选地，所述密码子优化是根据大肠杆菌密码子的偏好，利用
Codon Optimization By Generalbiol
软件对芽孢杆菌环氧化物水解酶的编码基因进行密码子优化
。
[0008]优选地，所述的重组大肠杆菌是以
pET
系列载体表达芽孢杆菌环氧化物水解酶
。
[0009]优选地，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌
BL21
（
DE3)。
[0010]第二方面，本专利技术提供一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌的构建方法，其包括：将
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列与载体连接，构建表达载体；将构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌
。
[0011]根据本专利技术的较佳实施例，所述构建方法为：（1）根据大肠杆菌的偏好，将芽孢杆菌环氧化物水解酶基因进行密码子优化，在体外合成经过密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶基因
EH
，所述基因
EH
为
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列，其含有
BamH I
和
Hind III
酶切位点；（2）将所述基因
EH
和
pET
‑
28a
（
+
）质粒分别用
BamH I
和
Hind III
双酶切，然后将酶切产物连接，得到重组质粒
pET
‑
28a
（
+
）
‑
EH
；（3）将重组质粒
pET
‑
28a
（
+
）
‑
EH
转化至 E. coli Top 10
感受态细胞，筛选阳性克隆，大量培养阳性克隆并提取重组质粒
pET
‑
28a
（
+
）
‑
EH
，再将重组质粒
pET
‑
28a
（
+
）
‑
EH
转入
E.coli BL21(DE3)
，筛选得到目标重组大肠杆菌
E. coli EH。
[0012]第三方面，本专利技术提供一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌，其命名为
Escherichia coli EH
，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号
CCTCC NO
：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌异源表达了密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶；所述密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶的编码基因是如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列
。2.
根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述密码子优化是根据大肠杆菌密码子的偏好，利用
Codon Optimization By Generalbiol
软件对芽孢杆菌环氧化物水解酶的编码基因进行密码子优化
。3.
根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是以
pET
系列载体表达芽孢杆菌环氧化物水解酶
。4.
根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌
BL21
（
DE3)。5.
一种产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠菌株的构建方法，其特征在于，其包括：将
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列与载体连接，构建表达载体；将构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到产芽孢杆菌环氧化物水解酶的重组大肠杆菌
。6.
根据权利要求5所述的重组大肠菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：（1）根据大肠杆菌的偏好，将芽孢杆菌环氧化物水解酶基因进行密码子优化，在体外合成经过密码子优化的芽孢杆菌环氧化物水解酶基因
EH
，所述基因
EH
为
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列，其含有
BamH I
和
Hind III
酶切位点；（2）将所述基因
EH
和
pET
‑
28a
（
+
）质粒分别用
BamH I
和
Hind III
双酶切，然后将酶切产物连接，得到重组质粒
...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭仁，吴燕红，陈妮，徐婧然，郝昳昕，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：