细胞尺度可控的工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种细胞尺度可控的工程菌及其构建方法和应用

【技术实现步骤摘要】
细胞尺度可控的工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种细胞尺度可控的工程菌及其构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]谷氨酸棒杆菌
(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)
是一种常见的革兰氏阳性菌，生长过程中不产生芽孢，细胞呈短杆状或小棒状，两端钝圆，不分枝，有时微弯曲
。
由于不产内毒素
、
具有强大的分泌系统且无致病性，谷氨酸棒杆菌被广泛应用于发酵工业，可以高效生产氨基酸
、
有机酸
、
多糖
、
多肽
/
蛋白等各种食品或医药
。
[0003]以透明质酸
((Hyaluronic acid,HA)
这一多糖产品为例
。HA
是由葡萄糖酸和
N
‑
乙酰基葡萄糖胺通过
β
‑
1,3
和
β
‑
1,4
糖苷键交替连接组成的天然多聚糖
。
透明质酸具有极强的锁水保湿能力
、
高度粘弹性
、
润滑性和良好的生物相容性，在化妆品
、
临床医学
、
保健品等领域均有广泛应用，且市场需求不断上升，发展潜力巨大
。
[0004]谷氨酸棒杆菌作为
HA
的生产菌株，具有基因背景清晰r/>、
关键酶系丰富
、
基因操作简单
、
不存在天然
HA
水解酶等优点，受到学术界和产业界的共同关注
。
已有大量研究者通过基因工程
、
代谢工程
、
发酵条件优化等多种手段强化重组谷氨酸棒杆菌中的
HA
合成，分别获得不同产量和不同分子量范围的
HA。
例如，
Wang
等人通过途径工程耦合在发酵过程中添加水蛭透明质酸酶的组合策略，将重组谷氨酸棒杆菌合成低分子量
(
约5万道尔顿
)HA
的产量提升至
74.1g/L(Wang Y,Hu L,Huang H,et al.Eliminating the capsule
‑
like layer to promote glucose uptake for hyaluronan production by engineered Corynebacterium glutamicum[J].Nat Commun,2020,11:3120)。Cheng
等人则基于基因组规模代谢网络模型优化及模块化代谢工程，将
HA
产量提高到
28.7g/L
，分子量
20
‑
90
万道尔顿
(Cheng F,Yu H,Stephanopoulos G.Engineering Corynebacterium glutamicum for high
‑
titer biosynthesis of hyaluronic acid[J].Metabolic Engineering,2019,55:276
‑
289.)。
[0005]透明质酸合成酶是结合在细胞膜上的膜蛋白，截至目前，通过精密调增谷氨酸棒杆菌细胞尺度实现透明质酸合成酶表达强化及重组谷氨酸棒杆菌发酵生产
HA
总产量提高的研究尚未见报道
。
类似地，采用细胞形态和大小尺度精密调控方法来控制其它膜结合酶基因，包括但不限于几丁质合成酶基因
、
三磷酸腺苷酶合成基因表达的方法，也未见报道
。

技术实现思路

[0006]基于此，本申请实施例的主要目的包括提供细胞尺度可控的工程菌及其构建方法和应用
。
[0007]在本申请的第一方面，提供一种细胞尺度可控的工程菌，主要是用含有目标基因及调控所述目标基因的启动子的重组载体转化谷氨酸棒杆菌构建而成，
[0008]所述目标基因包括阿拉伯糖转运蛋白基因
araE
和细胞形态调控基因；
[0009]调控所述细胞形态调控基因的启动子为诱导型启动子
P
BAD
；
[0010]调控所述阿拉伯糖转运蛋白基因
araE
的启动子为适用于谷氨酸棒杆菌的强启动子，选自
P
H36
、P
tuf
、P
fba
、P
sod
和
P
gap
中的一个或者多个
。
[0011]在本申请的一些实施方式中，所述细胞形态调控基因选自细胞分裂蛋白基因
ftsZ、
细胞分裂蛋白基因
ftsA、Z
环定位蛋白基因
minC、Z
环定位蛋白基因
minD、
细胞分裂抑制基因
sulA、
肌动蛋白基因
mreB、
细胞骨架蛋白基因
rodZ
和细胞分裂调控蛋白基因
divIVA
中的一个或者多个
。
[0012]在本申请的一些实施方式中，所述目标基因还包括膜结合酶基因
。
[0013]在本申请的一些实施方式中，所述膜结合酶基因选自几丁质合成酶基因
、
三磷酸腺苷酶合成基因和透明质酸合成酶基因中的一个或者多个
。
[0014]在本申请的一些实施方式中，所述重组载体为
pECXK99E、pXMJ19、pXZ10145、pZL071
或者
pXT01。
[0015]在本申请的一些实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌
ATCC13032、
谷氨酸棒杆菌
ATCC31831、
谷氨酸棒杆菌
R127、Cg
‑△
ldh(1)/AB
或
Cg
‑△
ldh(2)/AB、C.gluglmS
‑
cgl2229h、C.glu
‑
glmS
‑
glt1、C.glu
‑
Δ
ldh/APdapB
‑
B、C.glu
‑
Δ
ldh/A
‑
PdapB
‑
B
‑
aF
或者
C.glu
‑
Δ
ldh
‑
aEG/A
‑
PdapB
‑
B
‑
aF
‑
aE。
[0016]在本申请本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种细胞尺度可控的工程菌，其特征在于，主要是用含有目标基因及调控所述目标基因的启动子的重组载体转化谷氨酸棒杆菌构建而成，所述目标基因包括阿拉伯糖转运蛋白基因
araE
和细胞形态调控基因；调控所述细胞形态调控基因的启动子为诱导型启动子
P
BAD
；调控所述阿拉伯糖转运蛋白基因
araE
的启动子为适用于谷氨酸棒杆菌的强启动子，选自
P
H36
、P
tuf
、P
fba
、P
sod
和
P
gap
中的一个或者多个
。2.
根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述细胞形态调控基因选自细胞分裂蛋白基因
ftsZ、
细胞分裂蛋白基因
ftsA、Z
环定位蛋白基因
minC、Z
环定位蛋白基因
minD、
细胞分裂抑制基因
sulA、
肌动蛋白基因
mreB、
细胞骨架蛋白基因
rodZ
和细胞分裂调控蛋白基因
divIVA
中的一个或者多个
。3.
根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述目标基因还包括膜结合酶基因；可选地，所述膜结合酶基因选自几丁质合成酶基因
、
三磷酸腺苷酶合成基因和透明质酸合成酶基因中的一个或者多个
。4.
根据权利要求1至3中任一项所述的工程菌，其特征在于，所述重组载体为
pECXK99E、pXMJ19、pXZ10145、pZL071
或者
pXT01。5.
根据权利要求1至3中任一项所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌
ATCC13032、
谷氨酸棒杆菌
ATCC31831、
谷氨酸棒杆菌
R127、Cg
‑△
ldh(1)/AB
或
Cg
‑△
ldh(2)/AB、C.gluglmS
‑
cgl2229h、C.glu
‑
glmS
‑
glt1、C.glu
‑
Δ
ldh/APdapB
‑
B、C.glu
‑
Δ
ldh/A
‑
PdapB
‑
B
‑
aF
或者
C.glu
‑
Δ
ldh
‑
aEG/A
...

【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，袁淑婷，郑煜堃，宋明晔，杜岩，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：