一种提高角质酶-锚定肽融合蛋白在大肠杆菌中表达水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高角质酶

【技术实现步骤摘要】
一种提高角质酶
‑
锚定肽融合蛋白在大肠杆菌中表达水平的方法


[0001]本专利技术涉及一种提高角质酶
‑
锚定肽融合蛋白在大肠杆菌中表达水平的方法，属于发酵工程领域
。

技术介绍

[0002]胶黏物是废纸回收再利用过程中产生的污染物，易滞留于纸张及设备表面，影响产品质量，造成设备损伤，严重影响废纸回收再利用的回收效率，其控制已成为提高废纸利用率亟待解决的问题
。
胶黏物的主要控制方法包括物理法
、
化学法和生物法
。
由于生物控制法具有环境友好
、
高效专一等特点，可有效降解聚醋酸乙烯酯
(PVAc)、
聚丙烯酸乙酯
(PEA)
等胶黏物主要成分，逐渐成为胶黏物控制技术的发展趋势
。
角质酶是一种可降解多种聚酯的多功能酶，锚定肽是一种能提高对特定物质锚定效果的短肽，前期研究表明，
Humicola insolens
角质酶
‑
锚定肽
OMP25
为两者融合蛋白
HiC
‑
OMP25
，能显著提高对胶黏物的降解效果
。
[0003]大肠杆菌
Escherichia coli
中表达的
HiC
‑
OMP25
目前还存在表达量较低等问题，因此亟需提升其表达量以满足工业化需求
。

技术实现思路

[0004]本专利技术对不同大肠杆菌宿主对于
HiC
‑
OMP25
的表达量以及
HiC
‑
OMP25
的性质做了对比，发现
HiC
‑
OMP25
酶活量在以
E.coli BL21(DE3)
为宿主时高于以
E.coli C43(DE3)
为宿主，但是进一步将不同宿主胞内胞外所产的
HiC
‑
OMP25
用于降解
PEA
中，结果显示，以
E.coli BL21(DE3)
为宿主时表达的胞外
HiC
‑
OMP25
对
PEA
几乎没有降解作用，而以
E.coli C43(DE3)
为宿主表达的胞内胞外
HiC
‑
OMP25
均对
PEA
有较好的降解效果
。
在此基础上，专利技术人利用
BATH(Bacterial Adhesion To Hydrocarbons)
方法检测上述菌体疏水性的变化，结果表明，重组表达
HiC
‑
OMP25
的
E.coli BL21(DE3)
的疏水吸附率
(19.49
％
)
高于含有空载体的
E.coli BL21(DE3)(2.27
％
)
，证明表达
HIC
‑
OMP25
可提高菌株的疏水性，据此推测，可能由于
HIC
‑
OMP25
聚集或者直接插入细胞膜表面，导致菌体疏水性提高，同时，由于角质酶本身的磷脂酶活性，可使细胞膜透性增强，因此，
E.coli BL21(DE3)
表达的
HiC
‑
OMP25
未能正确折叠，便分泌至胞外，影响了
HiC
‑
OMP25
在实际生产中的应用
。
[0005]在确定了宿主细胞之后，本专利技术再将二硫键异构酶或是二硫键异构酶和巯基氧化酶
(Erv1p)
的组合在大肠杆菌
E.coli C43(DE3)
中与
HiC
‑
OMP25
共表达，以提升
HiC
‑
OMP25
的表达量
。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在
E.coli C43(DE3)
中表达了
HiC
‑
OMP25
，所述
HiC
‑
OMP25
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0007]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达了编码二硫键异构酶
DsbC
的基因
dsbc、
或来源于
Homo sapiens
或
Arabidopsis thaliana
的二硫键异构酶
。
[0008]进一步的，所述重组大肠杆菌还表达了编码巯基氧化
Erv1p
的基因
erv1p、
或来源于
Rhinopithecus bieti
或
Rattus norvegicus
的巯基氧化酶
。
[0009]在一种实施方式中，所述编码二硫键异构酶
DsbC
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0010]在一种实施方式中，所述编码巯基氧化酶
Erv1p
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0011]在一种实施方式中，所述来源于
Homo sapiens
或
Arabidopsis thaliana
的二硫键异构酶的氨基酸序列分别如
SEQ ID NO.3
和
SEQ ID NO.4
所示
。
[0012]在一种实施方式中，来源于
Rhinopithecus bieti
或
Rattus norvegicus
的巯基氧化酶的氨基酸序列分别如
SEQ ID NO.6
和
SEQ ID NO.7
所示
。
[0013]在一种实施方式中，利用
pET
‑
20b(+)
载体表达编码
HiC
‑
OMP25
的核苷酸
。
[0014]在一种实施方式中，利用
pET
‑
24a(+)
表达编码二硫键异构酶
DsbC
的基因
dsbc
，或者利用
pCDFDuet
‑1共表达编码二硫键异构酶
DsbC
的基因
dsbc
和编码巯基氧化
Erv1p
的基因
erv1p。
[0015]本专利技术的第二个目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种生产融合蛋白
HiC
‑
OMP25
的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌
E.coli C43(DE3)
中表达氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的融合蛋白
HiC
‑
OMP25。2.
根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在所述重组大肠杆菌中还表达了二硫键异构酶
、
或者共表达二硫键异构酶和巯基氧化酶；所述二硫键异构酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
～4任一所示；所述巯基氧化酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
～7任一所示
。3.
根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用表达载体表达编码
HiC
‑
OMP25
的核苷酸；并利用表达载体表达编码二硫键异构酶的基因，或者，利用表达载体共表达编码二硫键异构酶和巯基氧化酶的基因；所述表达载体包括但不限于
pET
系列
、pRSFDuet、pCDFDuet
及
pETDuet。4.
一种生产
HiC
‑
OMP25
的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1～3任一所述重组大肠杆菌为生产菌株，发酵生产
HiC
‑
OMP25。5.
根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在
LB
培养基中培养得到种子液，再将种子液接种至
TB
培养基中在
35
～
40℃
，
150
～
200r
·
min
‑1培养1～
3h
后换至
20

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，张凤山，刘展志，刘燕韶，周景蓬，晏婷婷，
申请(专利权)人：山东华泰纸业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：