一种生产靶向治疗活性成分的可生成细菌纤维素工程菌及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种生产靶向治疗活性成分的可生成细菌纤维素工程菌及其制备方法，所述工程菌的宿主菌为能够分泌细菌纤维素的细菌，该宿主菌通过基因组插入外源片段或者导入外源质粒来表达活性成分；所述基因组插入片段或外源质粒中具有编码靶向治疗活性成分的基因；同时该工程菌保持原宿主菌分泌细菌纤维素的能力；本发明专利技术提供了一种可生成细菌纤维素膜的工程化细菌，其不仅可以生成纤维素膜，而且可以作为靶向治疗活性成分的反应容器，进而大量生产靶向治疗活性成分

【技术实现步骤摘要】
一种生产靶向治疗活性成分的可生成细菌纤维素工程菌及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种生产靶向治疗活性成分的可生成细菌纤维素的工程菌的制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]细菌是结构简单的原核微生物，其最显著的特点就是生长速度快，便于大规模培养
。
利用细菌已经可以实现生产更高效的抗肿瘤药物羟基喜树碱以及天然稀有的活性多肽或者蛋白质等药物等
。
尤其随着生物技术的发展，细菌被认为是生产蛋白药物的最佳反应容器
。
[0003]目前，通过一些微生物，例如木醋杆菌等，可以生成超纯的天然细菌纤维素
。
细菌纤维素是一种新型的生物医用工程材料，其具有很好的生物相容性且能够为细胞附着提供最佳的三维基质
。
细菌纤维素膜用途十分广泛，但是目前对可生成细菌纤维素的细菌的研究主要集中在对其所生成的纤维素膜功能的探索或将其纤维素膜进行修饰后在进行应用，而对可生成细菌纤维素的细菌进行工程化改造的研究却少之又少，可生成细菌纤维素的细菌的功能较为单一
。
如何通过产细菌纤维素工程菌的工程化改造增加工程菌的功能，是目前研究的空白地带
。

技术实现思路

[0004]针对细菌纤维素膜虽然用途广泛，但是可生成细菌纤维素膜的细菌功能单一的问题，在本专利技术中，利用合成生物学技术改造可生成细菌纤维素的细菌，使其可以作为靶向治疗活性成分的反应容器
。
本专利技术还解决了可生成细菌纤维素的细菌作为工程菌时可能会存在的变异，进而导致无法在生产靶向治疗活性成分的同时产生细菌纤维素的问题
。
通过本专利技术方法制备的工程菌批量生产靶向治疗活性成分，降低活性成分生产周期和成本，同时不影响可生成细菌纤维素的细菌的产细菌纤维素能力和效率，增加了可生成纤维素膜细菌的应用
。
[0005]本专利技术一个方面提供了一种可生产具有活性成分的细菌纤维素膜的工程菌，所述工程菌的宿主菌为能够分泌细菌纤维素的细菌，该宿主菌通过基因组插入外源片段或者导入外源质粒来表达活性成分；所述基因组插入片段或外源质粒中具有编码靶向治疗活性成分的基因；同时该工程菌保持原宿主菌分泌细菌纤维素的能力；
[0006]所述工程菌在插入外源片段或者导入外源质粒后进行了预筛选；所述预筛选为：
[0007]2‑
1)
将待筛选工程菌在固体培养基中培养；
[0008]2‑
2)
从固体培养基上挑选单克隆点分别在液体培养基中继续培养，观测其纤维素膜生成情况；
[0009]2‑
3)
选择静置后溶液中完全澄清且气液界面上具有纤维素膜产量的培养液进行扩大培养
。
[0010]进一步地，所述宿主菌选自未经改造或者改造后的木醋杆菌
、
巴氏醋杆菌
、
木葡糖酸醋杆菌
、
汉氏葡糖醋杆菌
、
醋化醋杆菌
、
产醋醋杆菌
、
气杆菌
、
根瘤杆菌
、
无色杆菌
、
土壤杆菌
、
假单胞杆菌
、
产碱杆菌
、
八叠球菌
、
动胶菌中的至少一种
。
[0011]进一步地，靶向治疗活性成分选自癌症
、
细菌感染
、
真菌感染
、
传染病
、
免疫疾病和遗传疾病的治疗药物
。
[0012]优选地，靶向抗菌活性成分选自具有抗细菌或抗真菌效果的蛋白或抗菌肽及其衍生物，更进一步地，表达所述抗细菌或抗真菌效果的蛋白时还要同时表达其对应的免疫蛋白
。
[0013]优选地，所述细菌感染选自病原菌铜绿假单胞菌
、
大肠杆菌
、
沙门氏菌或金黄色普通球菌引起的感染
。
[0014]优选地，所述抗细菌或抗真菌效果的蛋白为至少两种天然抗菌蛋白或抗菌肽的融合蛋白或融合肽
。
[0015]更优选地，所述抗细菌或抗真菌效果的蛋白选自天然细菌素或不同细菌素的融合蛋白
。
比如绿脓杆菌素
S1
，
S2
，
S3
，
S4
，
S5
；大肠杆菌素
E2
，
E3
，
Ia
，
Ib
，
A
，
B
，
N
；沙门氏菌
SalE2
，
SalE3
，
SalE7
，
SalE1a
，
SalE1a
；葡萄球菌素
Pep5
，
BacSp22。
[0016]更优选地，所述抗细菌或抗真菌效果的蛋白选自绿脓杆菌素
S2、
大肠杆菌素
E3
的融合蛋白
。
[0017]进一步地，在基因组插入片段或质粒中，抗细菌或抗真菌效果的蛋白具有第一启动子和第一
RBS
序列
。
[0018]进一步地，在基因组插入片段或质粒中，抗细菌或抗真菌效果的蛋白对应的免疫蛋白上游具有第二启动子
。
[0019]优选地，第一启动子选自
SEQ ID NO.1
‑5中的任意一项
。
[0020]优选地，第一
RBS
序列选自
SEQ ID NO.8
‑
11
中的任意一项
。
[0021]优选地，第一启动子为
SEQ ID NO.1
，第一
RBS
序列选自
SEQ ID NO.9。
[0022]优选地，第二启动子为任意能够启动免疫蛋白表达的启动子，优选为
J23118
启动子
。
[0023]进一步地，所述基因组插入片段或质粒中还包含表达抗菌药物的编码基因
。
[0024]本专利技术另一个方面提供了一种上述可生产具有活性成分的细菌纤维素膜的工程菌的制备方法，其包括如下步骤：
[0025]1)
制备质粒：所述质粒中包含至少一种编码治疗活性成分的基因；并将质粒转导入宿主菌内获得待筛选工程菌；
[0026]2)
将待筛选工程菌进行预筛选；
[0027]所述预筛选方法为：
[0028]2‑
1)
将待筛选工程菌在固体培养基中培养；
[0029]2‑
2)
从固体培养基上挑选单克隆点分别在液体培养基中继续培养，观测其纤维素膜生成情况；
[0030]2‑
3)
选择静置后溶液中澄清且气液界本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种可生产具有活性成分的细菌纤维素膜的工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为能够分泌细菌纤维素的细菌，该宿主菌通过基因组插入外源片段或者导入外源质粒来表达活性成分；所述基因组插入片段或外源质粒中具有编码靶向治疗活性成分的基因；同时该工程菌保持原宿主菌分泌细菌纤维素的能力；所述工程菌在插入外源片段或者导入外源质粒后进行了预筛选；所述预筛选为：2‑
1)
插入外源片段或者导入外源质粒的待筛选工程菌在固体培养基中培养；2‑
2)
从固体培养基上挑选单克隆点分别在液体培养基中继续培养，观测其纤维素膜生成情况；2‑
3)
选择静置后溶液中完全澄清且气液界面上具有纤维素膜产量的培养液进行扩大培养
。2.
权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述宿主菌选自未经改造或者改造后的木醋杆菌
、
巴氏醋杆菌
、
木葡糖酸醋杆菌
、
汉氏葡糖醋杆菌
、
醋化醋杆菌
、
产醋醋杆菌
、
气杆菌
、
根瘤杆菌
、
无色杆菌
、
土壤杆菌
、
假单胞杆菌
、
产碱杆菌
、
八叠球菌
、
动胶菌中的至少一种
。3.
权利要求1所述的工程菌，其特征在于，靶向治疗活性成分选自癌症
、
细菌感染
、
真菌感染
、
传染病
、
免疫疾病和遗传疾病的治疗药物
。4.
权利要求1所述的工程菌，其特征在于，靶向抗菌活性成分选自具有抗细菌或抗真菌效果的蛋白或抗菌肽及其衍生物，优选地，表达所述抗细菌或抗真菌效果的蛋白时还要同时表达其对应的免疫蛋白；优选地，所述细菌感染选自病原菌铜绿假单胞菌
、
大肠杆菌
、
沙门氏菌或金黄色普通球菌引起的感染
。5.
权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述抗细菌或抗真菌效果的蛋白为至少两种天然抗菌蛋白或抗菌肽的融合蛋白或融合肽；优选地，所述抗细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：高艳梅，金帆，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：