一种四倍体不结球白菜的育种方法技术

本发明专利技术为一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法，用０．１％（ｇ／ｍｌ，下文同）、０．１５％和０．２５％秋水仙素处理二倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系，以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系突变株为母本与相应的保持系突变株连续侧交５代，同时相应的保持系突变株自交，经选育驯化获得雄性不育性稳定的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系。该雄性不育系不育株率为１００％，株型直立、束腰、白梗、黄绿色近圆叶、单株重０．７～１．０千克，体细胞染色体数２ｎ＝４ｘ＝４０。该系统是生产四倍体杂交种最优化的制种手段。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属作物育种领域，涉及一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应保持系的育种方法，专用于四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的选育。二、技术背景不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)俗称小白菜、白菜、青菜，我国北方称“油菜”，原产中国。是我国南方最大众化的蔬菜，在蔬菜周年供应中占有举足轻重的地位。其天然种及各栽培种都是二倍体，即2n＝2x＝20。现有技术中有本专利技术人在国内外首次人工诱变四倍体不结球白菜“南农矮脚黄”新品种(南京农业大学学报，1990，13(2)P.33～40)；1992年育成四倍体不结球白菜杂交种“热优2号”(专利技术专利ZL93110536.6)。该专利品种已应用于生产。但是由于“热优2号”是由2个四倍体自交系配制的杂交种，生产种中有大量的自交种，使其F1代杂种率不能达到100％。利用雄性不育系生产F1代杂交种(即杂种优势最优化的杂交制种手段)可使F1代杂种率达到100％。目前国内外现有技术中还没有四倍体不结球白菜胞质雄性不育系，使其四倍体不结球白菜杂种优势利用受到了极大的限制。2、以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系C0代突变株为母本分别与保持系C0代突变株成对侧交，同时相应的保持系突变株自交，分别得到四倍体不结球白菜胞质雄性不育突变系C1代和相应的保持突变系C1代；3、选择雄性不育株率＞90％的四倍体雄性不育C1代突变系和相应的C1代保持突变系，连续侧交、驯化以恢复生活力和提高结实率、鉴定筛选雄性不育株率为100％的系统，直至C5代，同时相应的保持突变系自交至C5代，获得不育株率为100％雄性不育性稳定的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系，经细胞学鉴定，其体细胞染色体数均为2n＝4x＝40；4、上述方法选育的四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系，在植株营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花器、果实等)都表现出多倍体的巨大性，统计分析表明与二倍体雄性不育系和保持系相比，差异极显著(p≤0.001)，四倍体雄性不育系雄蕊退化，即花丝极短或无，花药小，为正常花药的1/3～1/4，且不开裂，白色戟状或三角形，其内无花粉，四倍体保持系雄蕊正常，花粉染色体数n＝2x＝20；四倍体胞质雄性不育系及保持系除雄性不育形状差异外，其它经济形状相同，为普通二月白春化型，株型直立束腰，株高24～28厘米，开展度22～26厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重0.7～1.0千克。技术效果本专利技术所提供的一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法所育成的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系与现有技术相比具有如下优点1、采用同时诱变雄性不育系和保持系的育种方法简单、有效、快速。如果按常规选育二倍体胞质雄性不育系的方法，需要通过远缘杂交导入不育源，再通过回交、侧交筛选保持系，一般需要6～7代。四倍体染色体比二倍体多一倍，在远缘杂交、回交、侧交过程中基因分离极其复杂，要想获得纯合基因的雄性不育系和保持系相当困难。故今未见成功报道。本专利技术克服了上述困难，获得成功。该项研究曾被列入江苏省“九五”农业科技重大项目(BG99501-3)资助。2、四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系比其二倍体在植株营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花器、果实等)都表现出多倍体的巨大性，统计分析表明差异极显著(p≤0.001)。四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系株型直立束腰，株高24～28厘米，开展度22～26厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重0.7～1.0千克。3、四倍体胞质雄性不育系其雄性不育性彻底，不受环境条件影响，不育株率达100％。该不育系只能与四倍体不结球白菜父本系配制四倍体F1代杂交种。由于其不与二倍体不结球白菜杂交，在生产上容易寻找隔离区，可降低生产成本。4、利用四倍体胞质雄性不育系所配制的F1代杂交种具有明显的倍性优势和杂种优势。四倍体丰产、抗病、优质不结球白菜杂交新品种选育已被列入江苏省“十五”农业科技攻关项目(BE2001321-2)。四倍体杂交种抗逆性、适应性、丰产性都显著优于二倍体雄性不育系所配制的F1代杂交种。如四倍体杂交种比二倍体杂交种增产达27％～30％。1.2选育过程(见附附图说明图1)1.2.1染色体倍性操作方法 1998年10月3日播种二倍体雄性不育系和保持系，在子叶期采用0.1％、0.15％和0.25％秋水仙素对其茎尖生长点分生细胞染色体进行加倍。处理时间10月11日～22日每天上午8时，下午3时，连续3天处理共6次，处理温度为22～24℃/16～18℃。每份材料处理400株，共计7200株，每份材料设对照20株。1.2.2四倍体间接鉴定方法1、营养器官鉴定参照刘惠吉[1]的方法。总变异率＝变异株数/总株数。诱变C0代，单株选择第2～5片真叶，叶片变圆、变厚，颜色变深，株型开展正常或轻微畸形的变异株，于11月8日定植，株行距18cm×20cm。2、气孔鉴定定植后，当植株8～10片叶完全伸展时取功能叶(以二倍体植株为对照)，用镊子迅速撕下下表皮，在99％乙醇中固定2～3秒钟，平铺于栽玻片上，加一滴1％KI溶液，盖上盖玻片，在OLYPA显微镜下进行镜检用测微尺测量气孔密度(30个视野)；气孔器长和宽(样本数N＝30)；单个保卫细胞叶绿体数量(N＝30)。并进行T测验比较二倍体与四倍体的差异。3、花粉鉴定1999年3月开花期，取套袋隔离开放花朵散粉花药的成熟花粉，涂散在栽玻片上，直接镜检。观察花粉形状，测量花粉长和宽(N＝30)，并进行T测验比较二倍体与四倍体的差异。4、花器及果实鉴定 用解剖镜测微尺或直接测量花蕾、花瓣、花药、花丝、子房、蜜腺、果实大小，样本数N＝30。1.2.3四倍体直接鉴定方法1、花粉母细胞减数分裂染色体数目鉴定(见附图2) 上午8～11时取四倍体保持系花期主枝或一级分枝未开放的花序，立即放入Carnoy固定液(3份95％乙醇1份冰醋酸)中固定24h，转入70％乙醇中保存。选0.8～1.6mm花蕾，拨出花药，置于1N盐酸中，60℃水浴酸解3～5min。用醋酸洋红染色2～4min后敲片、压片，镜检。2、根尖染色体数目鉴定(见附图3)参考杨汉民[3]去壁低渗法制备四倍体雄性不育系根尖染色体标本。1.2.4四倍体雄性不育系选育方法1、连续测交和自交1999年3月～4月对已鉴定的四倍体雄性不育变异株C0代为母本，四倍体保持系变异株C0代为父本作成对人工测交，相应父本自交。1999年10月(人工加代)、2000年4月、2001年3月和2002年3月选择不育性高、结实稔性高和经济性状优良的系统连续测交和自交。获得C5代四倍体雄性不育系及相应的保持系。2、结实稔性和雄性不育性测定从测交第一代开始测定雄性不育系及保持系结实稔性(用亲和指数表示)，花期亲和指数＝花期杂交30朵花所结种子数/角果数(样本数N＝10)；蕾期亲和指数＝蕾期杂交30朵花所结种子数/角果数；(样本数N＝10)。雄性不育不育株率及不育度测定参照柯桂兰[4]方法。1.2.5四倍体F1杂交种组合品比试验2001年3月利用四倍体雄性不育系配制F1杂交组合01P-43(4X CMS×4X亮白叶)、01P-25(4X CMS×4X五月蔓)及01P-44(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法，其特征在于：１）诱变四倍体用的秋水仙素溶液浓度为０．１％（ｇ／ｍｌ，下文同）、０．１５％和０．２５％，在子叶期处理二倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系（２ｎ＝２ｘ＝２０）的茎尖生长点 分生细胞，连续处理３天，每天２次，处理温度为昼２２～２４℃／夜１６～１８℃，筛选出第一代四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系突变株Ｃ↓［０］代，与未处理对照相比，Ｃ↓［０］代特征为：植株生长缓慢，叶片近圆形且厚、颜色深黄绿色，叶片下表皮气孔保卫细胞大，气孔密度小，花器官大，花瓣圆，颜色深黄，不育系与保持系区别在于前者表现雄性不育，后者雄性可育；２）以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系Ｃ↓［０］代突变株为母本分别与保持系Ｃ↓［０］代突变株成对侧交，同时相应的保持系突变株 自交，分别得到四倍体不结球白菜胞质雄性不育突变系Ｃ↓［１］代和相应的保持突变系Ｃ↓［１］代；３）选择雄性不育株率＞９０％的四倍体雄性不育Ｃ↓［１］代突变系和相应的Ｃ↓［１］代保持突变系，连续侧交、驯化以恢复生活力和提高结实率、鉴定筛选雄 性不育株率为１００％的系统，直至Ｃ↓［５］代，同时相应的保持突变系自交至Ｃ↓［５］代，获得不育株率为１００％雄性不育性稳定的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系，经细胞学鉴定，其体细胞染色体数均为２ｎ＝４ｘ＝４０；４）上述方法选 育的四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系，在植株营养器官（根、茎、叶）和生殖器官（花器、果实等）都表现出多倍体的巨大性，与二倍体雄性不育系和保持系相比，经统计分析，差异极显著（ｐ≤０．００１），四倍体雄性不育系雄蕊退化，即花丝极短或无，花药小，为正常花药的１／３～１／４，且不开裂，白色戟状或三角形，其内无花粉，四倍体保持系雄蕊正常，花粉染色体数ｎ＝２ｘ＝２０；四倍体胞质雄性不育系及保持系除雄性不育形状差异外，其它经济形状相同，为普通二月白春化型，株型直立束腰，株高２４～２８厘米，开展度２２～２６厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重０．７～１．０千克。...

【技术特征摘要】
1.一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法，其特征在于1)诱变四倍体用的秋水仙素溶液浓度为0.1％(g/ml，下文同)、0.15％和0.25％，在子叶期处理二倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系(2n＝2x＝20)的茎尖生长点分生细胞，连续处理3天，每天2次，处理温度为昼22～24C/夜16～18℃，筛选出第一代四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系突变株C0代，与未处理对照相比，C0代特征为植株生长缓慢，叶片近圆形且厚、颜色深黄绿色，叶片下表皮气孔保卫细胞大，气孔密度小，花器官大，花瓣圆，颜色深黄，不育系与保持系区别在于前者表现雄性不育，后者雄性可育；2)以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系C0代突变株为母本分别与保持系C0代突变株成对侧交，同时相应的保持系突变株自交，分别得到四倍体不结球白菜胞质雄性不育突变系C1代和相应的保持突变系C1代；3)选择雄性不育株率＞90％的四倍体雄性不育C1代突变系和相应的C1代保持突...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蜀宁，刘惠吉，李式军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]