一种胶原三肽组合物及其纯化方法技术

本发明专利技术提供一种从胶原蛋白酶解液中提取胶原三肽

【技术实现步骤摘要】
一种胶原三肽组合物及其纯化方法


[0001]本专利技术属于一种高纯度胶原三肽的提取及分离纯化方法，具体涉及一种利用鱼鳞或鱼皮酶解液中提取并分离得到高纯度胶原三肽的纯化方法
。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是由甘氨酸
、
脯氨酸
、
羟脯氨酸等多种氨基酸构成的纤维性蛋白质，分子量较高，为
300KDa(
千道尔顿
)
左右
。
比大部分蛋白质
(
分子量通常低于
100KDa)
要高，难以被人消化
、
吸收，通常需要降解成分子量
5000
以下的低分子量胶原蛋白多肽进行使用
。
低分子量胶原蛋白多肽也称为胶原蛋白，低分子量胶原蛋白在人体内可以降解，以氨基酸的形式被吸收
。
[0003]由于人工合成胶原蛋白肽成本昂贵，操作困难，因此目前低分子量胶原蛋白肽主要由蛋白质水解得到
。
小分子肽尤其是3个或3个以上的氨基酸脱水缩合形成的小分子量肽易于吸收
。
胶原蛋白肽通常具有独特的富含甘氨酸
‑
脯氨酸
‑
羟脯氨酸
(
或者甘氨酸
‑
x
‑
y)
的重复序列结构
。
这种重复序列结构基本单元形成的小肽称为胶原三肽
[0004](CTP)
，因此胶原三肽分子量通常约在
200
‑
300Da
左右，其衍生物
(
例如未完全水解
)
最高不超过
1000Da
，由于分子量小，因此容易透过皮肤被吸收
。
由多个氨基酸连接导致分子量超过
800
或
1000Da
时，由于分子量变大而无法快速通过皮肤被吸收
。
因此，胶原三肽
(
甘氨酸
‑
x
‑
y)
在医药
、
美容护肤品
、
保健品
、
食品等领域具有广泛的需求和价值
。
[0005]目前胶原蛋白提取原料主要为动物的皮，例如牛皮
、
猪皮
、
鱼皮等脂肪含量较高的组织作为原料，通过酶水解在内的一系列处理而获得胶原三肽组合物
。
但是所得产物中三肽的含量非常低
(
另外现有技术中对于油脂的去除效果较差，导致残留油脂，进而影响胶原三肽的质量
)。
目前对胶原蛋白肽的提取制备已经开发了多种复合蛋白酶，应用较广的蛋白酶有碱性蛋白酶
、
中性蛋白酶
、
木瓜蛋白酶
、
胰蛋白酶
、
胃蛋白酶
、
风味蛋白酶等
。
[0006]然而由于酶解的特性，其并不能得到高产率的胶原三肽分子；加上胶原三肽分离提纯困难，成本较高，导致胶原三肽的最终提取率不高，且纯度较低
。
现有技术得到的多肽产品中胶原三肽衍生物含量通常在
20
％以下，无法进一步纯化得到更高纯度的产品，导致其应用受到限制
。
[0007]因此，存在对制备高含量胶原三肽
(
甘氨酸
‑
x
‑
y)
的高效分离提纯方法的需求
。
[0008]CN 107532157 A
公开了制备胶原三肽的方法，步骤属于常规步骤，但是其采用了特定的胶原酶，提取过程繁琐，且相比较市场的常见酶，操作不便
。
[0009]CN 113789360 A
涉及胶原三肽的提取方法及制备的胶原三肽
。
采用酶法对鱼皮进行提取，通过采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶以
1:3
比例混合酶解法对鱼皮进行胶原蛋白肽的提取制备，同时加以
600W
的超声波进行处理
45min
，使鱼皮中对胶原蛋白肽的提取率提高了
15
％～
25
％，但是该方法并不能获得高含量的胶原蛋白肽
。
[0010]CN 108929381 A
提供了一种皮肤紧急修复用胶原三肽及其制备方法，选用贻贝科动物明胶作为原料，通过双酶水解法制备胶原三肽，选自菠萝蛋白酶
、
木瓜蛋白酶
、
无花果
蛋白酶和生姜蛋白酶
。
但是获得的三肽纯度并不高
。
[0011]上述现有技术基本上是在沿用现有制备工序的情况下，通过改进胶原蛋白水解工序或者所用酶的组合对小分子多肽含量进行改进，通过使用新型酶或酶的组合，从而提高胶原蛋白水解物的小分子肽含量
。
[0012]分子印迹聚合物是对目标分子具有特异性吸附能力的聚合物，目前分子印迹分离法已在固相萃取
、
分离纯化等领域广泛应用
。
然而目前尚未有分子印迹用于增强多肽分离的选择性吸附
。
[0013]鉴于上述关于胶原三肽纯化的现有技术没有涉及到从酶解液中进行大规模分离批量处理得到高纯度产品的描述
(
大部分小分子多肽产品中胶原三肽含量不高，一般不超过
20
％
)。
因此，在面对成分复杂的酶解液时，现有技术难以通过离子交换
、
硅胶或膜过滤从中直接纯化分离得到高纯度的胶原三肽类物质
(
甘氨酸
‑
x
‑
y)。
因此，基于胶原蛋白酶解液原料，开发成本低廉，适合工业化大批量分离纯化且产品纯度较高的胶原三肽提取分离技术具有重要的市场价值
。

技术实现思路

[0014]针对现有技术中从胶原蛋白酶解液中提取胶原三肽
(CTP)
存在的分离效率低
、
产物纯度不高等问题，本专利技术提供了一种基于磁性微球多肽分离
‑
固相特异性吸附萃取相结合的胶原三肽分离纯化工艺，以获得高含量的胶原三肽产品
(Gly
‑
X
‑
Y
，包括
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
在内
)。
该方法具有分离效率高
、
原料易于获取
、
成本低
、
适合工业化规模生产等优点
。
[0015]本专利技术的另一目的在于提供一种高含量或高纯度纯度的胶原三肽组合物产品，其具有不低于
95
％的小分子胶原肽
(
分子量不大于
1KDa)
含量；其中，所得组合物中胶原三肽
(Gly
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种从胶原蛋白酶解液中分离纯化胶原三肽的方法，所述胶原蛋白酶解液由胶原蛋白原料经预处理
、
复合酶酶解得到，所述酶解至少包括一种胶原蛋白酶；其特征在于，包括以下步骤：
1)
胶原蛋白酶解液经纳滤或超滤处理后进行非特异性吸附分离，所述非特异性吸附分离采用选自聚甲基丙烯酸酯基磁性微球或聚乙烯醇基磁性微球中的至少一种填料介质进行；优选地，所述非特异性吸附分离还采用二氧化硅进行预分离；
2)
采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化：将经过非特异性吸附分离所得的胶原肽上样于不同模板分子制备的分子印迹聚合物分离柱内进行特异性分离纯化；其中，所述的不同模板分子选自：端基为
Gly
的三肽模板分子
、
端基为
Gly
的二肽模板分子
、
胶原三肽特征氨基酸模板分子中的至少两种；其中，所述的胶原三肽特征氨基酸选自甘氨酸
、
羟脯氨酸中的至少一种
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤
S1
‑
S5
：步骤
S1
：制备酶解胶原肽溶液：对胶原蛋白原料预处理，得到粗胶原蛋白胶液；其中，所述胶原蛋白原料选自鱼鳞
、
脱脂鱼皮或二者混合物；步骤
S2
：将所得粗胶原蛋白胶液依次进行酸性酶解
、
碱性酶解行两次酶解，其中，所述酶解至少包括胶原蛋白酶；步骤
S3
：将制得的酶解胶原肽粗溶液进行超滤过滤；其中酶解胶原肽溶液经截留分子量为
2000
‑
3000D
的超滤膜过滤，得到超滤处理的酶解胶原肽溶液；步骤
S4
：基于磁性微球介质进行非特异性分离将经过超滤处理的酶解胶原肽溶液上样于分离柱，所述分离柱从上到下依次分段装填有介孔二氧化硅填料以及磁性微球填料，所述磁性微球填料由聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料
、PVA
磁性微球填料组成，其中上端介孔二氧化硅填料高度不超过总填料高度的
30
％；优选地，磁性微球填料中聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料
、PVA
磁性微球填料的质量用量为
0.5
‑
2:1
；步骤
S5
：梯度固相萃取纯化采用基于不同模板分子制备的分子印迹聚合物对上述经过非特异性分离处理的胶原三肽粗品溶液进行选择性纯化分离，其中，所述的不同模板分子包括：端基为
Gly
的胶原三肽模板分子
、
端基为
Gly
的二肽模板分子
、
胶原三肽特征氨基酸模板分子；其中，所述端基为
Gly
的胶原三肽模板分子选自
Gly
‑
Pro
‑
Hyp、Gly
‑
Hyp
‑
Pro
中的至少一种，所述端基为
Gly
的二肽模板分子选自
Gly
‑
Pro、Gly
‑
Hyp
中的至少一种，所述胶原三肽特征氨基酸模板分子选自甘氨酸
、
羟脯氨酸中的至少一种；其中，分别以上述不同的模板分子，采用丙烯酰胺类功能单体在丙烯酸酯类交联剂和引发剂存在下进行热聚合反应得到相应的聚合物，去除聚合物中的模板分子从而得到相应的分子印迹聚合物
。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤
S4
具体操作如下：
1)
将经过超滤处理的酶解胶原肽溶液浓缩后上样于分离柱，所述分离柱从上到下依次分段装填有介孔二氧化硅填料以及磁性微球填料，所述磁性微球填料由分段装填的聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料
、PVA
磁性微球填料组成，其中上端介孔二氧化硅填料高度不超过总
填料高度的
30
％，且装填于上部；聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料
、PVA
磁性微球填料的用量为
1:1
；其中，所述聚甲基丙烯酸酯磁性微球为聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，粒度
10
‑
50
微米；其中，所述聚乙烯醇磁性微球粒径
20
‑
50
微米；所述介孔二氧化硅粒径1‑
10
微米；
2)
先用体积分数
10
‑
20
％的乙醇水溶液洗脱除杂，然后依次用去离子水和3‑
8wt
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈媛媛，刘飞，李双祁，
申请(专利权)人：广州菲勒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：