检测棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的组合物制造技术

本发明专利技术属于真菌检测技术领域，具体涉及一种检测棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的组合物

【技术实现步骤摘要】
检测棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的组合物、方法及应用


[0001]本专利技术属于真菌检测
，具体涉及一种检测棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的组合物
、
方法及应用
。

技术介绍

[0002]侵袭性真菌病
(invasive fungal disease,IFD)
是指真菌侵入人体组织
、
血液，并在其中生长繁殖导致组织损害
、
器官功能障碍和炎症反应的病理改变及病理生理过程
。
近年来，随着免疫受损人群的不断增加，侵袭性真菌病的发病率逐年上升，其中最常见的是侵袭性念珠菌病
。
常见的治疗侵袭性念珠菌病的药物有棘白菌素
、
三唑类抗真菌药如伊曲康唑
、
氟康唑
、
泊沙康唑等，治疗念珠菌的抗真菌药物非常有限
。
并且随着耐药菌的不断出现，死亡率逐渐增加
。
[0003]为了更好地选择有效的治疗药物，需要对耐药菌进行快速检测
。
然而耐药菌株的分子检测方法有限，目前实验室主要的方法是基于培养阳性获得菌株后，进行体外药敏试验，确定耐药菌株，进一步提取
DNA
对耐药相关基因进行
PCR
扩增结合
sanger
测序
。
然而，培养的阳性率较低
、
体外药敏试验耗时较长
、
检测方法较繁琐等问题限制了耐药菌快速准确的检出，甚至耽误正确的治疗
。
因此，亟需建立一种准确
、
快速
、
灵敏的耐药真菌分子检测方法
。
[0004]对于各类治疗念珠菌的抗真菌药物的耐药机制，本领域技术人员已多有研究
。
棘白菌素的耐药机制主要是靶酶编码基因
FKS
热点区的突变
。
研究表明，棘白菌素耐药的白念珠菌有
90
％均由
FKS1
的
S641
和
S645
位点突变导致，
88
％光滑念珠菌由
FKS1、FKS2
的几个热点突变导致；耳念珠菌的棘白菌素耐药也主要由
FKS1
的热点突变介导
。
可见通过对
FKS
热点突变的检测从而检测棘白菌素耐药菌株的方法是可行的
。Baslashov
等人最先用多重分子信标
(molecular beacon
，
MB)Real
‑
time PCR
检测白念珠菌
FKS1
的
S645
突变
。Zhao
等人利用多重
MB
和熔解曲线的方法检测光滑念珠菌
FKS1
和
FKS2
的多个热点突变，能够在3小时内完成检测且准确率高达
100
％
。
念珠菌三唑类耐药的机制则更为复杂，除了
ERG11
点突变外，主要还包括
ERG11
过表达
、
外排泵过表达
、
转录因子突变等机制
。
而烟曲霉三唑类耐药主要由靶酶
Cyp51A
突变导致，据此研发的检测方法也相对较多
。Baslashov
等人首先利用多重
MB Real
‑
time PCR
检测
Cyp51A
第
54
位的突变，随后多重
MB
和
TaqMan
探针相继用于多个突变位点的检测
。
基于多重
real
‑
time PCR
的商品化检测试剂盒
AsperGenius(PathoNostics)
能够有效检测出
TR34
，
L98H
，
Y121F
，
T289A
突变，并成功用于
BALF
等临床样本的直接检测
。
然而，上述方法中只有
AsperGenius
评价了对于检测耐药菌和敏感菌混合时的检测能力，结果显示该方法在耐药菌：敏感菌比例低于
1:5
时即检测不到
。
[0005]近年来随着真菌感染的不断增多
、
广谱抗菌药的使用以及检测技术的进步，不同菌种的混合感染甚至敏感菌和耐药菌的混合感染越来越多
。
然而，传统的药物敏感性检测方法需要在培养阳性的基础上，且需要分离纯化混合的不同菌株，若在耐药菌的比例较低的情况下，很难检测到耐药菌的存在，导致不敏感药物的使用，加速耐药菌优势群的形成，
延误病情
。
[0006]位点特异封闭实时定量
PCR(Allele
‑
Specific Blocker Real
‑
time PCR
，
ASB Real
‑
time PCR)
是一种能有效检测出
SNP、Indel
的方法，具有敏感度高
、
需要的模板量少
、
检测速度快
、
能够在野生模板中检测到突变模板等特点
。
该方法最先用于肿瘤的诊断，能够在大量野生型组织中检测到含有突变的肿瘤细胞，灵敏度极高，能在突变细胞仅含
0.1
％时被检测到，并且适用于福尔马林包埋
‑
石蜡固定的肿瘤组织样本的检测
。
[0007]目前用于检测耐药真菌的技术研究较少，
CN113249452A
专利公开了一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合及其应用，主要包括用于检测突变位点
F641S、S645P
和
R1361H
的引物和探针，然而该方法难以实现三唑类耐药念珠菌的检测
。
并且现有检测方法很难检测敏感菌和耐药菌的混合感染
。
在前期研究中，我们将该方法应用到三唑类耐药的烟曲霉检测中，并且可以在敏感和耐药菌株混合感染时有效检出其中的耐药菌株
。
然而，检测耐药念珠菌尤其是光滑念珠菌和耳念珠菌的方法以及能够检测的突变位点比较局限，难度更大
。

技术实现思路

[0008]基于前期真菌监测工作中发现的棘白菌素耐药念珠菌的
FKS
突变和三唑类耐药念珠菌的
ERG11、PDR1
突变，本专利技术利用
ASB Real
‑
time PCR
原理设计特异性引物和探针，建立一种可以有效检测并在敏感和耐药本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于检测棘白菌素和
/
或三唑类耐药的念珠菌的组合物，其特征在于，所述念珠菌包括光滑念珠菌和
/
或耳念珠菌；所述组合物为如下引物探针组合中的任一种或多种：
(1)
组合一：包含用于检测光滑念珠菌
PDR1
‑
Y682C
位点的引物对
a、
探针
a
和封闭寡核苷酸
a
；所述引物对
a
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的正向引物
a
和
SEQ ID NO.2
所示的反向引物
a
，所述探针
a
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，所述封闭寡核苷酸
a
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；
(2)
组合二：包含用于检测光滑念珠菌
PDR1
‑
I380L
位点的引物对
b、
探针
b
和封闭寡核苷酸
b
；所述引物对
b
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示的正向引物
b
和
SEQ ID NO.6
所示的反向引物
b
，所述探针
b
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示，所述封闭寡核苷酸
b
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.8
所示；
(3)
组合三：包含用于检测光滑念珠菌
PDR1
‑
G346D
位点的引物对
c、
探针
c
和封闭寡核苷酸
c
；所述引物对
c
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.9
所示的正向引物
c
和
SEQ ID NO.10
所示的反向引物
c
，所述探针
c
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.11
所示，所述封闭寡核苷酸
c
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.12
所示；
(4)
组合四：包含用于检测光滑念珠菌
PDR1
‑
G1099D
位点的引物对
d、
探针
d
和封闭寡核苷酸
d
；所述引物对
d
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.13
所示的正向引物
d
和
SEQ ID NO.14
所示的反向引物
d
，所述探针
d
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.15
所示，所述封闭寡核苷酸
d
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.16
所示；
(5)
组合五：包含用于检测光滑念珠菌
FKS2
‑
S663P
位点的引物对
e、
探针
e
和封闭寡核苷酸
e
；所述引物对
e
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.17
所示的正向引物
e
和
SEQ ID NO.18
所示的反向引物
e
，所述探针
e
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.19
所示，所述封闭寡核苷酸
e
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.20
所示；
(6)
组合六：包含用于检测耳念珠菌
ERG11
‑
Y132F
位点的引物对
f、
探针
f
和封闭寡核苷酸
f
；所述引物对
f
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.21
所示的正向引物
f
和
SEQ ID NO.22
所示的反向引物
f
，所述探针
f
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.23
所示，所述封闭寡核苷酸
f
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.24
所示；
(7)
组合七：包含用于检测耳念珠菌
FKS1
‑
S639F
位点的引物对
g、
探针
g
和封闭寡核苷酸
g
；所述引物对
g
包含核苷酸序列如
SEQ ID NO.25
所示的正向引物
g
和
SEQ ID NO.26
所示的反向引物
g
，所述探针
g
的核苷酸序列如
SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦琦，刘伟，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：