引物对制造技术

本发明专利技术公开了引物对，所述引物对的核苷酸序列如

【技术实现步骤摘要】
引物对、红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及红色毛癣菌检测相关

。
更具体地说，本专利技术涉及一种引物对
、
红色毛癣菌
RPA
试纸条试剂盒及检测方法

技术介绍

[0002]红色毛癣菌是最常见的引起皮肤癣菌病的真菌
。
目前红色毛癣菌的检测仍然以传统的镜检和培养为主
。
只要用显微镜在取下的标本中找到菌丝和
(
或
)
孢子，诊断即成立
。
直接镜检检测操作简单，允许临床医生快速获得检测结果制定治疗方案
。
但是标本制备及检测者的专业水平对结果影响较大，在临床实践中，假阴性率达到
15
‑
30
％
。
真菌培养可以明确致病菌及其活力，且可以根据形态学鉴定至种属，但耗时久，需要4周及以上
。
[0003]近些年开始引入分子生物学技术用于甲真菌病的直接检测，包括
PCR
扩增联合凝胶电泳
、PCR
扩增联合酶切电泳
、PCR
‑
ELISA、PCR
‑
sequencing
和多重
real
‑
time PCR
，其优势在于敏感性和特异性均较高，并且不易受用药影响，但受到仪器设备的限制
。
[0004]重组酶聚合酶扩增
(Recombinase polymerase amplification assay
，
RPA)
是英国公司
TwistDx Inc
于
2006
年开发的核酸等温扩增技术
。RPA
检测包含三个关键酶：重组酶
、
单链
DNA
结合蛋白
(single
‑
stranded DNA
‑
binding protein
，
SSB)
和
DNA
聚合酶
。
重组酶与引物结合形成核酸蛋白复合体，该复合体在双链
DNA
中寻找定位同源序列后引发链交换反应形成
D
环结构，
SSB
稳定被置换的
DNA
单链，随后重组酶解离，聚合酶在引物3’‑
OH
端添加碱基启动聚合反应
。RPA
在
37
～
42℃
条件下，实现对目标片段有效等温扩增，
20min
即可完成反应，且操作简便
。RPA
技术结合测流层析试纸条
(lateral flow dipstick,LFD)
相结合形成
RPA
‑
LFD
检测体系，不需要电泳仪
、
荧光仪监测设备，可在
5min
内完成对扩增产物的快速可视化检测
。
目前国际上尚无基于
RPA
‑
LFD
检测红色毛癣菌的报道
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是提供一种引物对
、
红色毛癣菌
RPA
试纸条试剂盒及检测方法，能够实现红色毛癣菌的快速检测
。
[0006]为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，本专利技术提供了引物对，所述引物对的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示，所述引物对用于检测红色毛癣菌
。
[0007]本专利技术还提供了红色毛癣菌
RPA
试纸条试剂盒，包括所述的引物对
。
[0008]进一步地，还包括：
SEQ ID No.3
所示的探针；侧流层析试纸条
。
[0009]进一步地，所述探针5’
端用
FAM
修饰，3’
端用
C3
‑
Spacer
修饰
。
[0010]进一步地，所述侧流层析试纸条的结合垫中设置有胶体金包被的抗
FAM
抗体
。
[0011]进一步地，所述侧流层析试纸条上具有检测线和质控线，所述检测线处设置有链霉亲和素，所述质控线处设置有抗
FAM
抗体
。
[0012]本专利技术还提供了红色毛癣菌检测方法，利用所述的红色毛癣菌
RPA
试纸条试剂盒检测红色毛癣菌
。
[0013]进一步地，包括：提取待测样品的
DNA
；利用所述引物对和所述探针进行
RPA
扩增反应；利用所述侧流层析试纸条检测扩增产物
。
[0014]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0015]本专利技术设计了
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示的引物对，成功将
RPA
和侧流层析试纸条结合，用于检测红色毛癣菌，检测操作简单，具有较好的敏感性和特异性，检测速度快，适用于即时诊断，有较好的应用前景
。
[0016]本专利技术的其它优点
、
目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解
。
附图说明
[0017]图1为红色毛癣菌
assay
敏感性检测结果；
[0018]图2为红色毛癣菌
assay
特异性检测结果
。
具体实施方式
[0019]下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施
。
[0020]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加
。
[0021]本申请的实施例提供了引物对，所述引物对的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示，所述引物对用于检测红色毛癣菌；引物对的设计无标准流程，需要在满足一下规则的情况下，进行创造性劳动：
1)
引物长度一般在
15
‑
30
碱基之间；
2)
引物
GC
含量在
40
％
‑
60
％之间，
Tm
值最好接近
72℃
；
3)
引物3′
端要避开密码子的第3位；
4)
碱基要随机分布；
5)
引物自身及引物之间不应存在互补序列；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
和
SEQ ID No.2
所示，所述引物对用于检测红色毛癣菌
。2.
红色毛癣菌
RPA
试纸条试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对
。3.
如权利要求2所述的红色毛癣菌
RPA
侧流层析试纸条试剂盒，其特征在于，还包括：
SEQ ID No.3
所示的探针；侧流层析试纸条
。4.
如权利要求3所述的红色毛癣菌
RPA
试纸条试剂盒，其特征在于，所述探针5’
端用
FAM
修饰，3’
端用
C3
‑
Spacer
修饰
。5.

【专利技术属性】
技术研发人员：袁小英，严秋红，方帆，王千，黄欣，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：