一种检测传染性脾肾坏死病毒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测传染性脾肾坏死病毒

【技术实现步骤摘要】
一种检测传染性脾肾坏死病毒ISKNV的引物组、试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组
、
试剂盒和方法
。

技术介绍

[0002]ISKNV
成熟病毒粒子为二十面体，横切面为六边形，直径约为
150nm
，因该病主要引起鳜鱼的肾脏和脾脏肿大，故将其命名为传染性脾肾坏死病毒
。ISKNV
病毒的发病率高达
60
％以上，感染
ISKNV
病毒初期，病鱼活动力下降，体表有多处出血点，解剖后可见脾肾肿大坏死，肝表面有出血点，小肠有黄色透明流晶样液体，感染病毒7～
10d
后死亡率达
100
％，严重影响着我国鳜鱼养殖业的发展
。
[0003]现有技术中针对传染性脾肾坏死病毒的检测方法，包括病理解剖
、
电镜观察法
、
常规
PCR
和常规血清学方法等
。
然而，这些方法过程较为复杂，无法快速
、
灵敏的对传染性脾肾坏死病毒进行检测
。
此外，尽管荧光定量
PCR
检测方法已被广泛应用于多种病毒的检测之中，但目前还未见以
SYBR Green
荧光定量
PCR
检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的研究报道
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组
、
试剂盒和方法，该方法具有简便快捷
、
灵敏度高
、
特异性强的特点
。
[0005]本专利技术提供了一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示；所述下游引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.2
所示
。
[0006]本专利技术提供了上述技术方案的引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的试剂盒和
/
或试剂中的应用
。
[0007]优选的，所述检测的样本来源包括鲈鱼
、
鳜鱼和罗非鱼中的一种或多种
。
[0008]本专利技术提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组和
PCR
扩增试剂
。
[0009]优选的，所述
PCR
扩增试剂包括
SYBR GreenMasterMix。
[0010]优选的，所述引物组中上游引物和下游引物的浓度分别为
10
μ
M。
[0011]本专利技术还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组
DNA
为模板，利用检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组进行
SYBR Green
实时荧光
PCR
扩增，得到荧光定量
PCR
扩增曲线；
[0012]对所述荧光定量
PCR
扩增曲线进行分析并作出判断；
[0013]当所述荧光定量
PCR
扩增曲线的
Ct
值＜
35
时，则判定待测样本为阳性；
[0014]当无荧光定量
PCR
扩增曲线或所述荧光定量
PCR
扩增曲线的
Ct
值
≥35
时，则所述待测样本为阴性
。
[0015]优选的，所述待测样本包括：脾组织样
、
肾组织
、
肌肉组织
、
肠系膜和血液中的一种
或多种
。
[0016]优选的，所述
SYBR Green
实时荧光
PCR
扩增的反应体系以
20
μ
L
计，包括：
10.0
μ
L
的2×
SYBR Green Premix Ex Taq II
，
(1.9
～
2.1)
μ
L
的基因组
DNA
模板，
0.8
μ
L 10
μ
M
的上游引物，
0.8
μ
L 10
μ
M
的下游引物，无
RNA
酶水补至
20
μ
L。
[0017]优选的，所述实时荧光
PCR
扩增的反应程序为：
95℃
预变性
30s
，
95℃
变性
5s
，
58
～
61℃
退火
34s
，运行
40
个循环
。
[0018]有益效果：
[0019]本专利技术提供了一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示；所述下游引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.2
所示
。
该引物组是针对
ISKNV
的保守序列设计得到的，能够特异性地检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV。
[0020]基于上述技术优势，本专利技术还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组
DNA
为模板，利用检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组进行
SYBR Green
实时荧光
PCR
扩增，得到荧光定量
PCR
扩增曲线；对所述荧光定量
PCR
扩增曲线进行分析并作出判断；当所述荧光定量
PCR
扩增曲线的
Ct
值＜
35
时，则判定待测样本为阳性；当无荧光定量
PCR
扩增曲线或所述荧光定量
PCR
扩增曲线的
Ct
值
≥35
时，则所述待测样本为阴性
。
实验表明，采用本专利技术提供的检测方法能够特异性地将
ISKNV
病毒，最低检出限为
6.71
×
100copies/...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种特异性检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示；所述下游引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.2
所示
。2.
权利要求1所述的引物组在制备检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的试剂盒和
/
或试剂中的应用
。3.
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测的样本来源包括鲈鱼
、
鳜鱼和罗非鱼中的一种或多种
。4.
一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物组和
PCR
扩增试剂
。5.
根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述
PCR
扩增试剂包括
SYBR Green I、DNA
聚合酶
、dNTPs
和
Mg
2+
。6.
根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组中上游引物和下游引物的浓度分别为
10
μ
M。7.
一种检测传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的基因组
DNA
为模板，利用权利要求1中所述的引物组进行
SYBR Green
实时荧光
PCR
扩增，得到荧光定量
PCR
扩增曲线；对所述荧光定量
PCR
扩增曲线进行分析并作出判断；当所述荧光定量
PCR
扩增曲线的
Ct
值＜
35
时，则判定待测样本为阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国平，王天宇，熊昕获，张思祺，李桐，郭利伟，杨小林，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：