一种基于微滴式数字制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于微滴式数字PCR技术的大口黑鲈虹彩病毒检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测大口黑鲈虹彩病毒的特异性引物
、
特异性探针和基于微滴式数字
PCR
技术的检测方法
。

技术介绍

[0002]大口黑鲈
(Micropterus salmoides, Largemouth bass)
是一种适温较广的名优鱼类品种，深受广大消费者欢迎
。
目前我国大口黑鲈产量已突破
50
万吨
。
随着养殖规模和密度的不断扩大，多种病害日趋严重，涵盖了病毒性疾病
、
真菌性疾病
、
细菌性疾病和寄生虫病，其中大口黑鲈虹彩病毒
(Largemouth bass ranavirus, LMBV)
是最为主要的病毒性疾病病原之一，属于虹彩病毒科
(Iridoviridae)
蛙病毒属
(Ranavirus)。
感染
LMBV
而发病的大口黑鲈，典型的症状表现为体表局部溃疡，肝脾肿大，肝脏发白发黄等，有较高的死亡率
。
此外，
LMBV
不同分离株的致病性存在差异，一些分离株的感染不表现出明显的临床症状和死亡，可以使鱼种隐性带毒，诊断困难
。
目前，针对
LMBV
引起的疾病治疗暂无特效药物及商品化疫苗出现，现阶段以早期的预防和切断病原传播途径为主要手段
。
因此迫切需要建立一种可应用于养殖现场及实验室研究中的
LMBV
病原的快速
、
灵敏
、
特异
、
方便的诊断方法，为该病的预防控制提供支撑
。
[0003]现有的
LMBV
检测方法主要包括病毒分离培养
、
电镜观察
、
血清学方法以及核酸扩增技术，如常规
PCR、
荧光定量
PCR
和环介导等温扩增等
。
但这些方法都有一定的不足之处
。
[0004]新兴的微滴式数字
PCR
（
Droplet digital PCR
）是一种可以直接绝对定量的
PCR
技术，其工作流程大致可分为三个部分，即微滴生成
、PCR
扩增和信号读取
。
首先由微滴发生器将含有核酸分子的荧光
PCR
反应体系“分割”成数万个纳升级的微滴，核酸分子在各微滴中随机分装，每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有至少一个待检核酸靶分子，且每个微滴都是一个独立的
PCR
反应器
。
经
PCR
扩增后，微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为“1”，没有荧光信号的微滴判读为“0”（从而将荧光模拟信号数字化，因此该技术被称为“数字
PCR”），最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可直接给出待检靶分子的拷贝数浓度
。
该技术已被广泛用于病原体检测，特别是病毒载量的低水平定量，然而目前还没有建立检测
LMBV
的
ddPCR
方法
。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：基于此，本专利技术的目的在于提供一种检测大口黑鲈虹彩病毒的特异性引物
、
特异性探针和
ddPCR
方法
。
[0006]技术方案：实现上述专利技术目的的技术方案包括如下
。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性引物，所述特异性引物包括序列如
SEQ ID NO.1
所示的正向引物和序列如
SEQ ID NO.2
所示的反向引物
。
[0008]本专利技术的第二方面，提供了一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性探针，所述特异性探针的序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0009]本专利技术的第三方面，提供了一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的方法，包括以下步骤：以待测样品的
DNA
为模板，利用上述特异性引物和特异性探针，进行
ddPCR
扩增
。
[0010]本专利技术的第四方面，通过建立的荧光定量
PCR
方法与
ddPCR
方法对待检样品进行平行检测
。
[0011]在本专利技术中，根据
LMBV
的
MCP
基因序列设计引物和探针，并通过优化
ddPCR
扩增反应的反应条件，最终建立起基于
ddPCR
法检测
LMBV
的方法，该方法特异性强
、
重复性好
、
灵敏性高，为
LMBV
检测提供了更精准
、
高效的检测方案，可应用于科研和临床样品检测相关领域
。
附图说明
[0012]图1为实施例3中退火温度的优化实验结果图
。
[0013]图2为实施例4中特异性实验的结果图
。
[0014]图3为实施例4中灵敏性实验的结果图
。
[0015]图4为实施例4中重复性实验的结果图
。
[0016]图5为实施例5中临床样品检测的结果图
。
实施方式
[0017]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述
。
本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例
。
相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面
。
[0018]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同
。
本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术
。
本专利技术所使用的术语“和
/
或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合
。
[0019]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件
。
实施例中所用到的各种常用化学试剂均为市售产品
。
[0020]本专利技术的其中一些实施例中，公开了一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性引物，所述特异性引物包括序列如
SEQ ID NO.1
所示的正向引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括序列如
SEQ ID NO.1
所示的正向引物和序列如
SEQ ID NO.2
所示的反向引物
。2.
一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针的序列如
SEQ ID NO.3
所示
。3.
根据权利要求2所述的基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针的5’
修饰有荧光报告基团，3’
修饰有荧光淬灭基团
。4.
根据权利要求3所述的基于
ddPCR
法检测
LMBV
的特异性探针，其特征在于，所述荧光报告基团为
FAM
，所述荧光淬灭基团为
BHQ
‑
1。5.
一种基于
ddPCR
法检测
LMBV
的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的
DNA
为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和权利要求2～4任一项所述的特异性探针，进行
ddPCR
扩增
。6.
根据权利要求5所述的基于
ddPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵哲，杨文岐，喻飞，周兴虎，钱津，史燕，魏富成，
申请(专利权)人：河海大学，
类型：发明
国别省市：