一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的引物制造技术

本发明专利技术公开了一种扩增甲型流感病毒全基因组序列引物

【技术实现步骤摘要】
一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的引物、方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物药物
，具体涉及一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的引物
、
方法及应用
。

技术介绍

[0002]甲型流感病毒全基因组长约
13.5kb
，由8个节段组成，编码
11
种蛋白质
。
甲型流感病毒可感染人
、
马
、
猪
、
禽类等动物，根据其
HA
和
NA
的不同可将甲型流感病毒分为不同的型别
。
现有
16
种
HA(H1
‑
H16)
和9种
NA(N1
‑
N9)。
研究显示甲型流感病毒基因组
RNA 8
个节段的5’
端和3’
端均有十几个碱基的保守序列
(5
’
端有
13
个碱基；3’
端有
12
个碱基
)
，且保守序列反向互补形成一个锅柄状的
RNA
结构
。
利用这一特性可设计引物扩增甲型流感的全基因组
。
[0003]二代测序技术已广泛的用于各种病毒的全基因组测序，其中
illumina
测序平台应用最广，市场占有率最高
。illumina
二代测序对长片段文库构建主要有两种：一是通过超声打断
DNA
片段，链接接头建库测序；二是通过酶切的方法将
DNA
切割为
300bp
大小的片段，再用
PCR
技术将测序的接头连接
。
用
Nextera XT DNA librarypreparation
试剂盒构建文库时，通过转座子酶切割
DNA
，同时将一段测序引物加在切割
DNA
两端，随后通过
PCR
的方法在片段两端加上测序接头
。
这种建库方法的缺陷是转座子酶只会在距离末端
50bp
左右切割
DNA
，致使这部分序列不能加上接头，造成末端不能测得序列的问题
。

技术实现思路

[0004]针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的引物
、
方法及应用
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术的目的是提供一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的引物，包括：
[0007]FluA
‑
F:5
’‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGCAAAAG CAGG
‑3’
；
[0008]FluA
‑
R:5
’‑
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGTAGAA ACAAGG
‑3’
。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种扩增和检测甲型流感病毒全基因组序列的试剂盒，包含上述的扩增引物，
PCR
扩增的反应体系为：
[0010]2X PCR MIX 12.5uL
；
[0011]上游引物
0.2
μ
M
；
[0012]下游引物
0.2
μ
M
；
[0013]Taq DNA
聚合酶
1uL
；
[0014]ddH2O 5.5uL
；
[0015]RNA
模板
5uL
；
[0016]25uL。
[0017]优选的，扩增程序：
42℃
，
60min
反转录；
95℃
，
2min
变性，
94℃
，
30s
；
45℃
，
30s
；
68℃
，
3min
以上扩增步骤5个循环；
94℃
，
30s
；
57℃
，
30s
；
68℃
，
3min
以上扩增步骤
31
个循环
。
[0018]本专利技术的另一目的是提供一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，提取病毒
RNA
，反转录成
cDNA
，以权利要求1所示的引物对
cDNA
序列进行
PCR
扩增，最后对扩增片段进行建库，并对文库进行纯化和质控
。
[0019]优选的，扩增程序：
42℃
，
60min
反转录；
95℃
，
2min
变性，
94℃
，
30s
；
45℃
，
30s
；
68℃
，
3min
以上扩增步骤5个循环；
94℃
，
30s
；
57℃
，
30s
；
68℃
，
3min
以上扩增步骤
31
个循环
。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术将一段
illumina
公司测序平台接头序列加到了甲型流感病毒全基因扩增引物的5’
端，利用一对引物在一个
PCR
反应体系中同时可扩增出甲型流感病毒8个节段
。
由于甲型流感病毒8个节段末端序列保守，故此方法理论上可以扩增任何型别的甲型流感病毒
。
且本方法可以直接从甲型流感检测阳性的咽拭子样本所提的核酸中直接捕获全基因组序列，无需病毒分离
。
[0022]利用在扩增引物5’
端增加测序接头序列的方法，配合
Nextera XT DNAlibrary preparation
试剂盒建库，可有效提高末端测序的覆盖度
。
彻底解决了该试剂盒末端测序覆盖度较低的问题
。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例甲型流感病毒全基因组序列扩增条带
。
[0024]图2甲型流感病毒基因组
PB1
节段测序覆盖图
。
[0025]图3甲型流感病毒基因组
PB2
节段测序覆盖图
。
[0026]图4甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种扩增甲型流感病毒全基因组序列的引物，其特征在于，包括：
FluA
‑
F:5
’‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGCAAAAG CAGG
‑3’
；
FluA
‑
R:5
’‑
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGTAGAA ACAAGG
‑3’
。2.
一种扩增和检测甲型流感病毒全基因组序列的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的扩增引物，
PCR
扩增的反应体系为：
2X PCR MIX 12.5uL
；上游引物
0.2
μ
M
；下游引物
0.2
μ
M
；
Taq DNA
聚合酶
1uL
；
ddH2O 5.5uL
；
RNA
模板
5uL
；
25uL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李龙山，马学平，穆婷，蒯文和，张银豪，孙晓强，杨东智，曹慜，
申请(专利权)人：宁夏回族自治区疾病预防控制中心宁夏回族自治区性病艾滋病防治中心，
类型：发明
国别省市：