一种RNA-蛋白质复合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种RNA

【技术实现步骤摘要】
一种RNA
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蛋白质复合物及其应用


[0001]本专利技术涉及遗传工程、蛋白质工程、合成生物学、化学生物学等多学科交叉领域，具体地涉及RNA及RNA
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蛋白质相互作用检测，更具体地涉及一种RNA
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蛋白质复合物和采用该系统检测RNA及RNA
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蛋白质相互作用的方法。

技术介绍

[0002]RNA是生命活动中最重要的生物大分子之一，它不仅能将遗传信息从DNA传递到蛋白质，还在生命活动的多种功能调控方面发挥重要作用(Cech etal.Cell 2014.157:77
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94)。根据功能的不同，人们将RNA分为信使RNA(messenger RNA，mRNA)、转运RNA(transfer RNA，tRNA)、核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)、非编码RNA(non
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coding RNA，ncRNA)和环RNA(circular RNA，circRNA)等多种类型。mRNA将储藏在DNA序列中的遗传信息传递到蛋白质，tRNA和rRNA参与蛋白质的合成，ncRNA具有调控mRNA翻译、指导染色体沉默、参与核仁构建等多种作用，circRNA可吸附miRNA以解除miRNA对基因表达的抑制作用。此外，RNA还与多种多样的蛋白质相互作用来调控自身的合成、定位和功能(Gerstbergeret al.Nat Rev Genet2014.15:829
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845)。例如，RNA的生物合成、RNA的运输、RNA的剪接、RNA的甲基化等修饰、细胞质RNA处理小体(processing bodies，P
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bodies)(Anderson et al.BiochimBiophys Acta 2015.1849:861
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870)和应激颗粒(stress granules，SGs)(Khonget al.Mol Cell 2017.68:808
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820)的形成过程等，都有蛋白质的参与。通过上述分子生物学和生物化学机制，RNA直接参与了非常广泛的生命活动过程，包括细胞不对称分化、极性细胞的局部翻译、免疫细胞激活和记忆、癌细胞中可变剪接的异常积累等等(Eliscovichet al.The Journal of biological chemistry 2013.288:20361
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20368)。除了已知功能的RNA外，还存在着很多作用机制及功能尚未被揭示的RNA。研究特定RNA的时空分布和动力学，能够揭示由于RNA调控失衡导致的疾病的发生机制。因此，开发用于研究RNA时空分布的工具十分重要。此外，细胞内RNA功能的发挥大都有RNA结合蛋白的参与(Ramanathan et al.Nature methods 2019.16:225
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234；Jankowsky et al.Nat Rev Mol Cell Bio 2015.16:533
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544)，RNA结合蛋白的功能丧失或调控失衡与很多疾病相关。因此，在分子或活细胞水平研究RNA与蛋白质相互作用对RNA功能机制以及人类生理或疾病的研究至关重要。
[0003]在生命科学研究领域，活细胞成像是在细胞水平获取生命活动信息最直观、最真实的方法。在RNA的研究中，最直观的方法就是能够直接观察到它们在细胞中的合成、运输和定位，这就需要对细胞内的目的RNA进行标记和成像。然而，RNA的瞬变特性和低拷贝数，有的甚至是在一个细胞中只有一个拷贝(Schwanhausser et al.Nature 2011,473:337
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342)，给RNA的研究带来很大的困难，研究者们很难精确绘制RNA从合成到降解的生命过程。荧光蛋白(fluorescent protein,FP)能够在活细胞和活体中对目的蛋白进行定位标记，是监测蛋白表达、相互作用等动力学过程强有力的工具(Enterina et al.Current opinion in chemical biology 2015.27:10
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17)。然而，由于缺乏性质优良的天然荧光RNA，科学家
们很难对活细胞中的RNA直接进行研究。因此，性质优良的RNA成像工具，将在活细胞中RNA的检测和示踪方面发挥重要作用。
[0004]目前，可对细胞中特定RNA进行成像的技术包括荧光原位杂交技术(Fluorescence In
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Situ Hybridization，FISH)(Raj et al.Nature methods 2008.5:877
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879；Battich et al.Nature methods 2013.10:1127
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1133)、共价标记技术(Li,F et al.AngewandteChemie 2015.54:4597
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4602；Alexander et al.Journal of the American Chemical Society 2015.137:12756
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12759)、RNA结合蛋白
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荧光蛋白技术(RNA binding protein
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fluorescent protein，RBP
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FP)(Bertrand et al.Mol Cell 1998.2:437
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445；Batra et al.Cell 2017.170:899
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912)和荧光RNA技术(Paige et al.Science 2011.333:642
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646；Ouellet et al.Front Chem 2016.4:29)。FISH技术利用荧光团修饰的单链DNA作为荧光标签对核酸分子进行标记。共价标记技术通过共价修饰使荧光团分子与目的RNA发生化学反应，对目的RNA进行标记。RBP
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FP技术利用荧光蛋白作为荧光报告分子，与RNA结合蛋白融合，从而达到结合并标记RNA的目的。荧光RNA技术直接在目的RNA上融合RNA适配体，通过添加能够被RNA适配体结合并激活的染料，达到标记目的RNA的目的。
[0005]现有的RNA成像技术存在一些缺陷。原位杂交技术可以直接标记内源性RNA，不需要额外添加RNA靶点，但受限于细胞膜的核酸低渗透性，通常只能用于固定细胞或组织中RNA的成像，很难进行活细胞中RNA的成像。共价标记技术只需要在目的RNA上共价标记分子量很小的荧光团(<1kDa)，对目的RNA的影响较小，且标记稳定性好，但现有的共价标记通常也只能用于固定细胞。RBP
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FP技术能够对活细胞RNA进行成像，然而游离的融合荧光蛋白造成较高的背景荧光，为了提高信噪比，需要在目的RNA中插入多个结合模块，但是多分子融合荧光蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述RNA
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蛋白质复合物包括：a)N1
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N2或N2
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N1嵌合RNA，其中N1是任意感兴趣的靶标RNA序列，N2为RNA适配体；b)P1
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P2或P2
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P1重组融合蛋白，其中P1是RNA结合蛋白，P2为发光蛋白，并且，所述P1特异性识别结合所述N1。2.根据权利要求1所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述N1和N2之间可操作性连接，和/或，所述P1与P2之间可操作性连接。3.根据权利要求1所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述N2RNA适配体可以特异性识别结合荧光团分子。4.根据权利要求3所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述RNA适配体可选自Pepper RNA适配体、Clivia RNA适配体、Broccoli RNA适配体、Red Broccoli RNA适配体、Orange BroccoliRNA适配体、Corn RNA适配体、Spinach RNA适配体、Spinach2 RNA适配体、iSpinachRNA适配体、Chili RNA适配体、DNB RNA适配体、SRB
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2RNA适配体、13
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2min RNA适配体、A1RNA适配体、A RNA适配体、AT RNA适配体、DIR
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Apt1 RNA适配体、DIR2s
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Apt RNA适配体、Mango RNA适配体、MGA RNA适配体，或其任何一种的生物活性变体或片段。5.根据权利要求3所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述荧光团分子可选自HBC485、HBC497、HBC508、HBC514、HBC525、HBC530、HBC599、HBC620、IV
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39、IV
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17、IV
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20、IV
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18、IV
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21、IV
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19、IV
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22、IV
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37、IV
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4、IV
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3、IV
‑
2、IV
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1、IV
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6、IV
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5、DFHBI、DFHBI
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1T、DFHBI
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2T、BI、OBI、TBI、DFHO、DIR、OTB
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SO3、OTB
‑
T
‑
SO3、DIR
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Pro、SR
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DN、TMR
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DN、RG
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DN、DMHBI
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Imi、DMHBI
+
、DMHBO
+
、TO1、TO3、MG。6.根据权利要求1所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述发光蛋白可催化特定的底物分子产生特定波长的光。7.根据权利要求6所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述发光蛋白可选自深海细角刺虾荧光素酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、铁路蠕虫荧光素酶、细菌荧光素酶、高斯荧光素酶、水母发光蛋白、Arachnocompa荧光素酶，或其中任何一种的生物活性变体或片段，或其中两种或更多种的嵌合体。8.根据权利要求6所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，所述底物分子可选自荧光素、腔肠素、Furimazine，或其中任何一种的衍生物或类似物。9.根据权利要求1所述的RNA
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蛋白质复合物，其特征在于，P1可以与N1结合，促使P2催化底物产生的特定波长光经生物发光共振能量转移激活N2RNA适配体
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荧光团分子复合物产生荧光。10.如根据权利要求9所述的RNA
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蛋白质复合物，P1和N1可选自来源于噬菌体的MCP衣壳蛋白与MS2发夹RNA、N蛋白与boxB RNA、U1A蛋白与U1 snRNAstem loop2 RNA、HnRNP C蛋白与Poly U RNA、LARP7蛋白与7SK SL4 RNA、Nova
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1蛋白与UCAGUCAC基序RNA、STAR蛋白与ACUAAC RRE、Fox
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1蛋白与UGCAUGU RRE、TAP蛋白与CTE RNA、ZRANB2蛋白与AGGUAA RRE，或其任何一种的生物活性变体或片段。11.如根据权利要求10所述的RNA
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蛋白质复合物，P1和N1还可包含它们的串联体、环状更替突变体，或其任何一种的生物活性变体或片段，或其中两种或更多种的嵌合体。12.如根据权利要求1所述的RNA
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蛋白质复合物，P1
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P2或P2
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P1重组融合蛋白可选自
NLuc
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MCP、NLuc
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cpMCP、NLuc
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dMCP、NLuc
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dMCP
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Y85G、NLuc
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dMCP
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K43G、NLuc
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dMCP
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E63G、NLuc
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dMCP
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N55G/K57G、NLuc
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dMCP
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E89G/T91G、NLuc
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，陈显军，谢鑫，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：