质粒及制造技术

本发明专利技术公开了非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂药物筛选与活性检测平台，在

【技术实现步骤摘要】
质粒及ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及抗病毒药物筛选方法，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂药物筛选与活性检测平台
。

技术介绍

[0002]绿色荧光蛋白（
GFP
）最初是在维多利亚多管发光水母（
Aequorea victoria
）中发现的，它在没有任何外源底物的情况下吸收蓝光并发出绿色荧光
。
在过去的二十年中，设计了几种改进荧光光谱的绿色荧光蛋白变体，包括增强型绿色荧光蛋白
EGFP、YFP、Venus
等
。
[0003]基于
GFP
的诸多优点，譬如广谱性
、
稳定性
、
易于载体构建与检测
、
无毒害，
GFP
在细胞筛选
、
基因表达
、
细胞标记
、
遗传跟踪等领域被广泛应用
。GFP
作为一种活体报告蛋白同时它的荧光强度很高，易于活体观测和用仪器进行定量检测
。GFP
主要由
11
股
β
链组成的桶状结构和其中的发色团组成，而发色团通过大量氢键稳定在中间位置
。
其三级结构对于荧光的产生是十分重要的，蛋白质变性及分离的发色团都无法产生荧光
。
通常情况下，为了不破坏
GFP
的三级结构，均是在其
N
端和
C
端进行多种蛋白质的融合
。
[0004]非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（
African Swine fever virus
，以下简称“ASFV”）引发的一种烈性传染疾病
,
病死率高达
100%。
[0005]ASFV
属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是一种双链
DNA
病毒
。
世界动物卫生组织将
ASFV
分为一个血清型，
24
种基因型
。
其基因组长度因基因型的不同有所差异，在
170
至
194 kb
之间相对应包含了
151
至
167
个
ORF。
其中有
110
个
ORF
是高度保守的
。
[0006]ASFV
基因组编码约
50
个结构蛋白占总蛋白的三分之一到四分之一
。
这些结构蛋白包括
pP220
，
pP62
，
P72
，
P30
，
CD2V
蛋白等
。ASFV
颗粒主要由结构蛋白组成，结构蛋白是
ASFV
的主要框架
。
结构蛋白在
ASFV
侵入宿主到复制繁衍的各个感染阶段起着不可替代的作用
。
其中
pP220
和
pP62
多聚蛋白是
ASFV
多个重要的结构蛋白前体
。
多个成熟的病毒粒子蛋白是由
pP220
和
pP62
蛋白被
S273R
蛋白酶水解产生的
。
这些被切割出的成熟蛋白约占病毒结构蛋白总量的
32
％，是病毒核心的主要成分
。
故
S273R
蛋白酶是非洲猪瘟抗病毒药物研发的重要靶点
。
迄今为止，尚没有治疗非洲猪瘟的特效药物
。
[0007]大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在
BSL
‑2或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺
。
目前，
ASFV
‑
S273R
蛋白酶抑制剂的活性评价方法主要为荧光共振能量转移法或者利用活病毒进行检测
。
荧光共振能量转移法是目前应用较为广泛的高通量筛选方法，具有快捷
、
灵敏
、
可定量和重复性好等优点，但荧光剂易受小分子化合物影响而导致假阳性问题，同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，在细胞内没有活性或活性很弱
。
因此，开发一种简洁
、
安全
、
高通量和可重复性的蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂筛选及活性检测平台十分必要
。

技术实现思路

[0008]为了解决上述问题，本专利技术提供了非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂药物筛选与活性检
测平台，首先提供了可用于检测
ASFV
蛋白酶抑制剂活性的质粒，本专利技术在
GFP
中插入
ASFV
的的
S273R
蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的
GFP
报告蛋白质粒，在上述改造后的
GFP
报告蛋白质粒上，克隆表达
ASFV
蛋白酶，可用于检测
S273R
蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成
ASFV
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台
。
本专利技术能有效克服上述蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用
ASFV
活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，
BSL
‑1级实验室即可满足实验要求，是高效
、
准确
、
稳定
、
高通量
、
可重复的用于
ASFV
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台
。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术首先提供了一种可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，所述质粒包含改造的
GFP
荧光蛋白的编码核苷酸序列以及非洲猪瘟病毒蛋白酶的编码核苷酸序列；所述的改造的
GFP
荧光蛋白内部包含可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列；所述可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列插入于野生型
GFP
荧光蛋白的位置包括
site1
或
site2
，
site1
位于如
SEQ ID NO.5
所示的氨基酸序列的
KQ
和
KN
之间，
site2
位于如
SEQ ID NO.6
所示的氨基酸序列的
QK
和
NG
之间；所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶为
S273R。
[0010]作为本专利技术的一种优选方案，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，其特征在于，所述质粒包含改造的
GFP
荧光蛋白的编码核苷酸序列以及非洲猪瘟病毒蛋白酶的编码核苷酸序列；所述的改造的
GFP
荧光蛋白内部包含可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列；所述可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列插入于野生型
GFP
荧光蛋白的位置包括
site1
或
site2
，
site1
位于如
SEQ ID NO.5
所示的氨基酸序列的
KQ
和
KN
之间，
site2
位于如
SEQ ID NO.6
所示的氨基酸序列的
QK
和
NG
之间；所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶为
S273R。2.
根据权利要求1所述的可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.7
所示，所述蛋白酶切割序列包括：
cut1
如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列
、cut2
如
SEQ ID NO.2
所示的氨基酸序列
、cut3
的氨基酸序列为
GGG
或
cut4
的氨基酸序列为
GGN。3.
根据权利要求1或2所述的可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，其特征在于，所述的野生型
GFP
荧光蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：武小琰，潜奕青，方晨捷，宋家升，
申请(专利权)人：杭州百裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：