一种用于制造技术

本发明专利技术属于基因合成技术领域，具体涉及一种用于

【技术实现步骤摘要】
一种用于DNA序列合成的方法


[0001]本专利技术属于基因合成
，具体涉及一种用于
DNA
序列合成的方法
。

技术介绍

[0002]基因序列合成是指将短的
DNA
序列通过
PCR、
等温聚合或者连接的方法连接起来，形成长的
、
完整的基因序列，是合成生物学领域不可或缺的关键技术
。
基于连接的方法是将端部带有粘末端的两段或多段
DNA
连接起来
。
粘末端可由多种方式产生，例如限制性内切酶切割
、T5
核酸外切酶酶切，即
Gibson
组装等
。
近年来对于两端引物序列的改造和依赖于
CRISPR
体系的切割也越来越多地得到应用
。
但使用粘末端连接方式进行基因合成需面临一些问题，例如多酶体系共同作用
、
或者带有修饰的寡核苷酸链的应用所带来的成本增加；常温发挥作用的酶在自动化仪器不理想的且长时间的保存条件下活性的维持
。
这些问题使得基于连接的基因组装方式更适合在高难度序列
、
长序列组装领域有很好的应用，但是对于长度＜
20k
的序列组装来说，连接的组装方式其成本
、
稳定性和操作复杂程度决定了其并不是一个很好的工业生产方式
。
[0003]基于
PCR
方法的
DNA
合成弥补了连接合成方式的一些短板，例如：（1）反应温度高，有利于减少
DNA
二级结构的干扰；（2）试剂体系成熟，反应各组分都预先混合到一起，操作方便；（3）
Taq
酶活性高且不易失活，不需要严格的保存条件，有利于应用到自动化设备上；（4）短
DNA
序列不需要特殊修饰，成本低廉
。
但是
PCR
合成方式自身也有着较为明显的缺点需要克服：（1）在
PCR
反应中容易产生副产物，且副产物种类较复杂；（2）反应中解为单链，相似序列或者高
GC
序列容易形成二级结构或错配，降低组装效率；（3）热循环条件根据序列复杂程度和长度会有相应变化，导致
PCR
反应条件需要经常摸索，无法固定下来，难以进行标准的批量合成
。

技术实现思路

[0004]针对以上技术问题，本专利技术提供了一种用于
DNA
序列合成的方法
。
该方法快速
、
高特异
、
反应条件固定，可用于自动化
、
高通量的
DNA
合成
。
[0005]为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：第一方面，本专利技术提供用于
DNA
序列合成的方法，具体包括如下步骤：
S1、
将待合成
DNA
序列的
5'
端和
3'
端分别加入通用序列作为目标
DNA
序列，根据所述通用序列设计
PCR
引物
UF
和
UR
；根据目标
DNA
的序列信息设计
2n
个
DNA
单链，依次编号为
D
‑
1、D
‑2…
D
‑
2n
，
n
大于等于1，相邻的两条
DNA
单链之间分别各有一段重叠序列，每条
DNA
单链上重叠序列的总长度小于该
DNA
单链的长度；
S2、
合成
S1
所述
DNA
单链，分别以无核酸酶水溶解，执行以下任一种方案：
a、
将所述
DNA
单链溶液预混，得到至少一个预混体系；
b、
将所述
DNA
单链溶液分组预混后进行
PCR
扩增，所述分组预混为
D
‑1与
D
‑2预混，
D
‑3与
D
‑4预混，以此类推，经
PCR
扩增后共得到
n
个扩增产物体系；
c、
根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向
DNA
单链，共
n
‑1个，依次编号为
P
‑
2、P
‑4…
P
‑
(2n
‑
2)
；将所述
DNA
单链溶液和重叠区反向
DNA
单链分组预混；所述分组预混包括
D
‑
1、D
‑2与
P
‑2预混，
D
‑
3、D
‑4与
P
‑4预混，以此类推，
D
‑
(2n
‑
1)、D
‑
2n
与通用引物预混，共得到
n
个预混体系；
d、
根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向
DNA
单链，共
n
‑1个，依次编号为
P
‑
2、P
‑4…
P
‑
(2n
‑
2)
；将所述
DNA
单链溶液和重叠区反向
DNA
单链分组预混；所述分组预混包括
D
‑
1、D
‑2与
P
‑2预混，
D
‑
3、D
‑4与
P
‑4预混，以此类推，
D
‑
(2n
‑
1)、D
‑
2n
与通用引物预混，共得到
n
个预混体系；将所述预混体系进行
PCR
扩增，得到
n
个扩增产物体系；
S3、
利用已修饰连接序列的固定相将
S2
所得预混体系或扩增产物体系进行
DNA
合成；
S4、
用所述引物
UF
和
UR
对
S3
所得
PCR
扩增产物进行
PCR
扩增，得到所述目标
DNA
的完整序列
。
[0006]本专利技术提供的上述用于
DNA
序列合成的方法在合成过程中不易产生无产物，具有高特异性；不易形成二级结构或错配，组装效率高；反应条件固定，易于进行批量合成，可用于自动化
、
高通量的
D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于
DNA
序列合成的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、
将待合成
DNA
序列的
5'
端和
3'
端分别加入通用序列作为目标
DNA
序列，根据所述通用序列设计
PCR
引物
UF
和
UR
；根据目标
DNA
的序列信息设计
2n
个
DNA
单链，依次编号为
D
‑
1、D
‑2…
D
‑
2n
，
n
大于等于1，相邻的两条
DNA
单链之间分别各有一段重叠序列，每条
DNA
单链上重叠序列的总长度小于该
DNA
单链的长度；
S2、
合成
S1
所述
DNA
单链，分别以无核酸酶水溶解，然后执行以下任一种方案：
a、
将所述
DNA
单链溶液预混，得到至少一个预混体系；
b、
将所述
DNA
单链溶液分组预混后进行
PCR
扩增，所述分组预混为
D
‑1与
D
‑2预混，
D
‑3与
D
‑4预混，以此类推，经
PCR
扩增后共得到
n
个扩增产物体系；
c、
根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向
DNA
单链，共
n
‑1个，依次编号为
P
‑
2、P
‑4…
P
‑
(2n
‑
2)
；将所述
DNA
单链溶液和重叠区反向
DNA
单链分组预混；所述分组预混包括
D
‑
1、D
‑2与
P
‑2预混，
D
‑
3、D
‑4与
P
‑4预混，以此类推，
D
‑
(2n
‑
1)、D
‑
2n
与通用引物预混，共得到
n
个预混体系；
d、
根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向
DNA
单链，共
n
‑1个，依次编号为
P
‑
2、P
‑4…
P
‑
(2n
‑
2)
；将所述
DNA
单链溶液和重叠区反向
DNA
单链分组预混；所述分组预混包括
D
‑
1、D
‑2与
P
‑2预混，
D
‑
3、D
‑4与
P
‑4预混，以此类推，
D
‑
(2n
‑
1)、D
‑
2n
与通用引物预混，共得到
n
个预混体系；将所述预混体系进行
PCR
扩增，得到
n
个扩增产物体系；
S3、
利用已修饰连接序列的固定相将
S2
所得预混体系或扩增产物体系进行
DNA
合成；所述连接序列与
S1
中所述通用序列反向互补；
S4、
用所述引物
UF
和
UR
对
S3
所得
PCR
扩增产物进行
PCR
扩增，得到所述目标
DNA
的完整序列
。2.
根据权利要求1所述的用于
DNA
序列合成的方法，其特征在于，所述重叠序列为：对于相邻两条
DNA
单链，如前一条为对应目标
DNA
序列的第
a
到
b
号碱基，
a
小于
b
，后一条对应目标
DNA
序列的第
c
到
d
号碱基，
c
小于
d
，则
c
小于
b
，
c
到
b
号碱基序列为所述重叠区域
。3.
根据权利要求1所述的用于
DNA
序列合成的方法，其特征在于，所述
DNA
单链的长度为
15~300nt
；和
/
或所述重叠序列的长度小于
≤40bp
；和
/
或
S2
中所述
PCR
扩增的反应条件为：
90~95℃
，
1~300s
高温预变性；
90~95℃
，
1~60s
高温变性，
50℃~68℃
，
10~120s
退火，
72℃
，
10~300s
延伸，共进行
1~20
个循环；
72℃
，
60~600s
的后延伸；和
/
或
S2
中每个预混体系中
DNA
单链总浓度为
0.001pmol/
μ
L~50pmol/
μ
L
；和
/
或
S3
中所述
PCR
扩增的反应条件为：
90~95℃
，
1~300s
高温预变性；
90~95℃
，
1~60s
高温变性，
50℃~68℃
，
10~120s
退火，
72℃
，
10~300s
延伸，共进行
1~40
个循环；
72℃
，
60~600s
的后延伸
。4.
根据权利要求
1~3
任一项所述的用于
DNA
序列合成的方法，其特征在于，
S1
中编号为
D
‑
1、D
‑3…
D
‑
(2n
‑
1)
的
DNA
单链为正向
DNA
单链，编号为
D
‑
2、D
‑4…
D
‑
2n
的
DNA
单链为反向
DNA
单链；相邻的两条
DNA
单链
5'
端有一段重叠反向互补序列，即所述重叠序列；所述正向
DNA
单链的序列从
5'
端到
3'
端与所述目标
DNA
序列从
5'
端到
3'
端的一部分相同，所述反向
DNA
单链除所述重叠序列外的序列从
3'
端到
5'
端与所述目标
DNA
序列从
5'
端到
3'
端的一部分互补
。
5.
根据权利要求4所述的用于
DNA
序列合成的方法，其特征在于，
S2
的
a
方案中所述预混的具体操作包括：将所述
DNA
单链按编码顺序分为至少两组，每组含有连续编码的偶数个
DNA
单链，将各组中正向
DNA
单...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋炎，张宏宇，杨丹，娄倩倩，孙隽，
申请(专利权)人：天津中合基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：