一种慢病毒的制备方法及其应用技术

本申请公开一种慢病毒的制备方法，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。本申请还公开上述的制备方法在慢病毒包装中的应用。的应用。的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒的制备方法及其应用


[0001]本说明书涉及生物
，特别涉及一种慢病毒的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒，与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点，并已经应用于多种疾病的基因治疗研究中。
[0003]慢病毒载体是一种以HIV
‑
1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础的基因治疗载体，慢病毒包装系统目前已经过三代的更迭，优化至四质粒系统，有效提高了慢病毒的生物安全性。其主要的四质粒系统包括Gag
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Pol基因、ReV基因、VSV
‑
G包膜基因以及载体质粒。前三种为辅助质粒，载体质粒也被称作主质粒。病毒滴度(TU)为病毒的毒力或毒价，其是判定病毒转染效果的主要参考值之一。三种辅助质粒通过不同比例混合，对转染后病毒滴度会产生较大影响。现有的慢病毒转导技术并未对三种辅助质粒的配比进行过多的工艺开发，导致其转染滴度不高。

技术实现思路

[0004]本申请提供一种慢病毒的制备方法，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％ CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。
[0005]本申请还提供上述的制备方法在慢病毒包装中的应用。
[0006]本说明书提出的慢病毒制备方法，带来的有益效果包括但不限于：(1)降低质粒的用量，优化包装比例，提高病毒出毒量，同时降低物料成本；(2)使用本申请提供的慢病毒制备方法，包装的慢病毒滴度高(≥1E+09TU/ml)，杂质水平低。
附图说明
[0007]本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
[0008]图1为根据本申请一些实施例所示的pLVX
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Puro载体图谱。
具体实施方式
[0009]为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标
号代表相同结构或操作。
[0010]如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
[0011]本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
[0012]本申请提供一种慢病毒的制备方法，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％ CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。
[0013]术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0014]术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。
[0015]术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。
[0016]在一些实施例中，所述转染试剂可以为聚阳离子类转染试剂。在一些实施例中，优选的，所述转染试剂可以为聚乙烯亚胺。在一些实施例中，更优选的，所述转染试剂可以为聚乙烯亚胺25000。在一些实施例中，进一步优选的，所述转染试剂可以为聚乙烯亚胺25000的水溶液。在一些实施例中，所述转染试剂的溶度可以为0.8～1.2μg/μL。在一些实施例中，优选的，所述转染试剂的溶度可以为1μg/μL。
[0017]在一些实施例中，所述质粒可以包括包装质粒和慢病毒表达载体质粒。在一些实施例中，所述包装质粒可以包括pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV
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Rev。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒可以为pLVX
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CD19 CAR。
[0018]在一些实施例中，所述转染试剂工作液可以为转染试剂的Dynamis培养基溶液。在一些实施例中，所述质粒工作液可以为质粒的Dynamis培养基溶液。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为150～210：95～225。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为160～200：105～215。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为165～195：115～205。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为170～190：125～195。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为175～185：135～185。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为175～185：145～175。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为175～185：155～165。
[0019]在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为160：225。
[0020]在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV
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Rev的质
量比可以为35～160：10～35：10～25：15～25。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV
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Rev的质量比可以为45～150：12～32：12～22：16～24。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV
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Rev的质量比可以为55～140：14～30：14～20：17～23。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV
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Rev的质量比可以为60～130：16～28：16本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒的制备方法，其特征在于，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：所述转染试剂为聚阳离子类转染试剂，优选的，所述转染试剂为聚乙烯亚胺；更优选的，所述转染试剂为聚乙烯亚胺25000；进一步优选的，所述转染试剂为聚乙烯亚胺25000的水溶液；和/或，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为160：225。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转染试剂的溶度为0.8～1.2μg/μL；优选的，所述转染试剂的溶度为1μg/μL；所述质粒包括包装质粒和慢病毒表达载体质粒，所述包装质粒包括pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV
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Rev；所述慢病毒表达载体质粒为pLVX
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CD19 CAR。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转染试剂工作液为转染试...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜子文，周静雨，栗红建，张丹，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：