间充质干细胞凋亡囊泡及其亚型、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了间充质干细胞凋亡囊泡及其亚型、其制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的制备方法包括：S1.采用STS诱导间充质干细胞凋亡；S2.将诱导所得的包含有凋亡细胞、碎片、凋亡囊泡的悬液进行离心，以沉淀凋亡细胞及碎片，收集上清液；S3.将S2收集到的上清液再次离心，以沉淀凋亡小体，分别收集离心后的沉淀及上清液；S4.将S3所得上清液再次离心以沉淀提纯凋亡囊泡。本发明专利技术首次分离出了间充质干细胞凋亡囊泡的不同亚型，深入到了亚型层次的研究。本发明专利技术惊奇地发现，间充质干细胞凋亡囊泡的不同亚型表现出不同的生理活性。本发明专利技术首次将诱导凋亡的脂肪来源的间充质干细胞囊泡用于促进糖尿病皮肤伤口的愈合。用于促进糖尿病皮肤伤口的愈合。用于促进糖尿病皮肤伤口的愈合。

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞凋亡囊泡及其亚型、其制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及间充质干细胞凋亡囊泡及其亚型、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]细胞凋亡，即程序性细胞死亡的过程，其中不需要的细胞被破坏和去除。细胞凋亡在炎症调节、组织稳态维持、发病机制、发育和衰老中起着重要作用。这些程序性死亡细胞可以释放大量细胞外囊泡，这些囊泡被称为为凋亡囊泡。一些研究报道，凋亡囊泡可以从间充质干细胞中分离出来，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞和牙髓干细胞等。间充质干细胞衍生的凋亡囊泡在各种疾病中显示出治疗效果，如骨缺损、口腔疾病、内分泌疾病。
[0003]糖尿病慢性伤口是糖尿病(DM)最具挑战性的并发症之一。这些伤口由于治疗时间长，费用高，导致严重的身体、心理和经济负担。此外，糖尿病慢性伤口经常表现为感染或深部组织损伤，使其成为非创伤性截肢的主要原因。现有技术中的伤口修复方法，如局部负压、生长因子和自体富含血小板的凝胶，但由于潜在的微环境改变导致伤口周围细胞功能受损，这些传统的治疗方法往往对许多患者无效。伤口愈合过程依赖于一系列动态的生理事件，包括止血、炎症、增殖和重塑。这一过程中的任何破坏，例如由于高葡萄糖环境导致的过度炎症和参与修复的细胞功能障碍，都会导致伤口愈合延迟和慢性伤口的发展。糖尿病患者伤口愈合受损源于高血糖引起的与伤口相关的细胞功能障碍。炎症细胞功能障碍和炎症因子失调是糖尿病伤口愈合炎症期的特征。高血糖微环境导致巨噬细胞功能障碍和持续向促炎M1表型极化，同时炎症因子变得失调，导致持续炎症状态，阻碍伤口愈合。糖尿病伤口愈合的增殖期以成纤维细胞和内皮细胞的生理功能受损为特征，导致肉芽组织形成和血管生成受损，从而进一步阻碍伤口愈合。因此，解决持续性炎症、细胞增殖和迁移受损以及血管生成减少对于治疗难治性或禁忌性伤口至关重要。这就需要探索更有针对性的治疗方案。
[0004]随着组织工程技术的迅速发展，细胞治疗在各个领域得到了广泛的应用。间充质干细胞(MSCs)已成为一种理想的治疗细胞类型，并在加速糖尿病皮肤伤口愈合和恢复皮肤完整性方面显示出良好的效果。最初，MSCs被认为在植入后回到损伤部位进行自我更新和定向分化，并通过分泌生长因子、细胞因子和细胞外囊泡(EVs)促进组织修复。然而，最近的研究报道，在兔皮肤伤口愈合模型中，移植的MSCs在移植后不久就发生了广泛的凋亡。同样，另一项研究表明，MSCs在移植后经历了广泛的caspase激活和凋亡。这就严重限制了MSCs的应用。
[0005]此外，凋亡囊泡具有多种不同的亚型，现有技术中对于凋亡囊泡的研究还未深入到亚型层次，在治疗过程中具体是何种亚型发挥的作用尚不明确，针对其不同亚型的分离方法及质量控制方面是现今亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一在于，提供一种间充质干细胞凋亡囊泡的制备方法，方法简单，操作简便，采用该方法能制备多种来源的间充质干细胞凋亡囊泡，如骨髓间质干细胞、脂肪间充质干细胞，同时本专利技术方法还能分离得到间充质干细胞凋亡囊泡的多种亚型。
[0007]本专利技术的目的之二在于，提供采用上述制备方法得到的骨髓间质干细胞凋亡囊泡的亚型。
[0008]本专利技术的目的之三在于，提供骨髓间质干细胞凋亡囊泡的亚型在制备促进细胞增殖及迁移的药物中的应用。
[0009]本专利技术的目的之四在于，提供采用上述制备方法得到的脂肪间充质干细胞凋亡囊泡。
[0010]本专利技术的目的之五在于，提供脂肪间充质干细胞凋亡囊泡在制备治疗糖尿病皮肤伤口愈合的药物中的应用。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0012]本专利技术公开的一种间充质干细胞凋亡囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1.采用星孢菌素(STS)诱导间充质干细胞凋亡；
[0014]S2.将诱导所得的包含有凋亡细胞、碎片、凋亡囊泡的悬液进行离心，以沉淀凋亡细胞及碎片，收集上清液；离心条件为：700～900g离心8～12min；
[0015]S3.将S2收集到的上清液再次离心，以沉淀凋亡小体，离心条件为2800～3200g离心28～32min，分别收集离心后的沉淀及上清液；其中沉淀为一种凋亡囊泡亚型，将其重悬后备用；
[0016]S4.将S3所得上清液于15000～17000g离心28～32min以沉淀提纯凋亡囊泡，所得沉淀重悬后得到凋亡囊泡悬液，备用。
[0017]本专利技术的部分实施方案中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。
[0018]本专利技术的部分实施方案中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞时，还包括步骤S5：将步骤S4所得凋亡囊泡悬液依次通过孔径为0.45μm、0.22μm的滤膜，得到三种骨髓间充质干细胞凋亡囊泡亚型的，三种骨髓间充质干细胞凋亡囊泡亚型的直径分别为：<0.22μm、0.22
‑
0.45μm、0.45
‑
1μm。
[0019]本专利技术中，在步骤S3的前提下进行S4所得囊泡直径均小于1μm。本专利技术的部分实施方案中，所述步骤S5中，采用切向流过滤系统分离得到三种凋亡囊泡亚型。
[0020]本专利技术的部分实施方案中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞时，所述步骤S1中，取骨髓间充质干细胞传代培养后，收集第2～10代中的任意一代骨髓间充质干细胞，再加入诱导剂STS诱导骨髓间充质干细胞凋亡；
[0021]优选地，取3
‑
5代骨髓间充质干细胞进行诱导；
[0022]优选地，STS的工作浓度为100nM～1000nM，优选为250nM～1000nM；更优选为500nM～1000nM，进一步优选为500nM；
[0023]优选地，诱导凋亡的时间为0.5h～12h。
[0024]本专利技术的部分实施方案中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞时，所述步骤S1中，取脂肪间充质干细胞传代培养后，收集第2～10代中的任意一代间充质干细胞，再加
入诱导剂STS诱导间充质干细胞凋亡；
[0025]优选地，STS的工作浓度为100nM～1000nM，优选为200nM～500nM；更优选为300nM；
[0026]优选地，诱导凋亡的时间为0.5h～24h，优选为6～12h，更优选为12h。
[0027]本专利技术还公开了上述方法得到的骨髓间充质干细胞凋亡囊泡亚型，其直径为<0.22μm，或直径为0.22
‑
0.45μm，或直径为0.45
‑
1μm。
[0028]本专利技术公开的骨髓间充质干细胞凋亡囊泡亚型在制备促进细胞增殖及迁移的药物中的应用。
[0029]本专利技术还公开了上述方法得到的脂肪间充质干细胞凋亡囊泡；优选地，脂肪间充质干细胞凋亡囊泡的粒径为50
‑
500nm。
[0030]本专利技术公开的脂肪间充质干细胞凋亡囊泡在制备治疗糖尿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采用STS诱导间充质干细胞凋亡；S2.将诱导所得的包含有凋亡细胞、碎片、凋亡囊泡的悬液进行离心，以沉淀凋亡细胞及碎片，收集上清液；离心条件为：700～900g离心8～12min；S3.将S2收集到的上清液再次离心，以沉淀凋亡小体，离心条件为2800～3200g离心28～32min，分别收集离心后的沉淀及上清液；其中沉淀为一种凋亡囊泡亚型，将其重悬后备用；S4.将S3所得上清液于15000～17000g离心28～32min以沉淀提纯凋亡囊泡，所得沉淀重悬后得到凋亡囊泡悬液，备用。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。3.根据权利要求2所述的一种间充质干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞时，还包括步骤S5：将步骤S4所得凋亡囊泡悬液依次通过孔径为0.45μm、0.22μm的滤膜，得到三种骨髓间充质干细胞凋亡囊泡亚型的，三种骨髓间充质干细胞凋亡囊泡亚型的直径分别为：<0.22μm、0.22
‑
0.45μm、0.45
‑
1μm。4.根据权利要求3所述的一种间充质干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间...

【专利技术属性】
技术研发人员：田卫东，杨建，张轩豪，廖立，汤颖峰，张静怡，
申请(专利权)人：成都世联康健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：