一种高效胞内递送的氟工程化外泌体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种高效胞内递送的氟工程化外泌体及其应用。本申请中，发明专利技术人利用静电作用和疏水作用将外泌体与FPG3进行了结合来制备获得氟工程化外泌体exo@FPG3，用于提高外泌体的细胞摄取效率以及促进其从溶酶体中逃逸概率。在此基础上，达到提升外泌体的胞内递送效率的技术目的，进而可较好满足促进细胞成管和细胞迁移等组织修复的研究应用。初步实验结果表明，本申请制备的氟工程化外泌体exo@FPG3与未被氟功能化的肽类树状分子与外泌体作用制备的exo@PG3相比，外泌体的氟化改性对提高细胞摄取效率以及增强相关功能表现出较好的技术效果。增强相关功能表现出较好的技术效果。增强相关功能表现出较好的技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种高效胞内递送的氟工程化外泌体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种高效胞内递送的氟工程化外泌体及其应用。

技术介绍

[0002]细胞生物学研究中，外泌体一般指直径30
‑
150 nm的囊泡性细胞器，由细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中所形成的，其中富含miRNAs、mRNA和蛋白质等物质。由于外泌体具有携带遗传物质和蛋白质转移功能，研究认为外泌体在细胞通讯中起着重要作用，也被认为是一种较为理想的药物递送载体。另外，间充质干细胞分泌的外泌体在炎症、慢性创面、心肌梗死等方面具有很好的生物活性，因此，外泌体用于组织工程的治疗或药物传递方面具有较好的应用潜力。
[0003]但实际应用中，外泌体的细胞内吞作用受外泌体与细胞膜的相互作用以及受体细胞的内吞能力的直接影响；此外，大约60%细胞摄取的外泌体被转运到溶酶体，进而消化外泌体的内容物。研究认为，可通过非特异性的相互作用或利用受体介导的特异性手段调节外泌体的内化过程。但总体上，目前关于细胞内吞能力的差异、外泌体表面修饰对细胞内运输的影响以及外泌体表面修饰可能增加溶酶体逃逸的影响等，目前研究较为有限。总之，在将外泌体作为一种有效的治疗工具之前，对于外泌体相关性能研究和调整，是实现其应用效果的前提保障。

技术实现思路

[0004]通过采用氟化肽类树状分子对外泌体进行表面修饰方法，本申请目的在于提供一种可以胞内高效递送的氟工程化外泌体，用于增强外泌体的胞内摄取效率，进而实现相关生物学功能。
[0005]本申请所采用的技术方案详述如下。
[0006]一种胞内递送的氟工程化外泌体，其主要是通过将氟化物通过静电作用和疏水作用结合在外泌体表面制备获得；具体通过如下步骤制备获得：（一）制备获得外泌体以脂肪来源的间充质干细胞（AMSCs）分泌的外泌体为例，具体制备方法如下：首先，将AMSCs在含有10%胎牛血清的DMEM中培养生长至完全融合；培养结束后，收集培养物，用超速离心法分离获得AMSCs分泌的外泌体，具体操作参数（均在4℃条件下进行）如下：先将含有AMSCs的培养基以2000 g离心30 min以去除死细胞和碎片；再将上清液小心地转移到新的离心管中，10000 g离心45 min以分离获得大囊泡；将获得的大囊泡经0.45 μm过滤器过滤后，将得到的上清液100000 g离心70 min，沉淀物即为外泌体；进一步地，对所得外泌体用预冷的PBS重悬后，再次100000 g离心70 min以进行纯
化；（二）与FPG3结合（即，利用氟化肽类树状分子FPG3对外泌体进行表面修饰）将一定质量的氟化肽类树状分子FPG3与步骤（一）中的外泌体混合均匀后，室温（15~30℃）下孵育15~30 min（具体例如20 min），获得氟工程化外泌体（exo@FPG3）；以质量比计，氟化肽类树状分子FPG3：外泌体=0.25~20（具体例如为：0.5、1、2.5、5、10、20等）；所述氟工程化外泌体exo@FPG3，是利用静电作用以及疏水作用将FPG3插入到带负电荷的外泌体的磷脂双分子层中，即，利用FPG3来修饰外泌体表面；所述氟化肽类树状分子FPG3，是指氟烃链修饰的赖氨酸树状分子，其中树状分子为低代数的肽类树状分子，其代数为1代、2代或者3代；所述氟烃链修饰的赖氨酸树状分子，通过氟烃链与赖氨酸树状分子反应制备获得；制备合成氟烃链修饰的赖氨酸树状分子时，反应的氟烃链摩尔数＞0，接枝率10%＜DS＜80%；所述氟烃链，0≤氟烃链的碳原子数n≤8；所述氟化肽类树状分子FPG3的分子量为2000~20000；所制备的氟工程化外泌体（exo@FPG3），较优情况下，表面电位约为9.6
ꢀ±ꢀ
0.6 mV。
[0007]所述胞内递送的氟工程化外泌体（exo@FPG3）在细胞生物学研究或者组织修复方面的应用，用于增强细胞摄取效率研究或应用，或者用于细胞成管和细胞迁移研究或应用（例如，细胞迁移以及成管是糖尿病足慢性创面修复中细胞功能的直接体现）。
[0008]所述氟化肽类树状分子FPG3，以（3
‑
氨基丙基）三乙氧基
‑
硅烷合成的 POSS（多面体低聚倍半硅氧烷）为核，以叔丁氧羰基保护的赖氨酸为结构单元，不断经过酰胺缩合以及洗脱保护得到不同代数的肽类树状分子；最后，再对该肽类树状分子进行氟化修饰；具体制备方法参考如下：（一）制备POSS
·
8HCl首先，在50℃条件下，向500 mL无水甲醇中滴加45 mL的浓盐酸；然后，升温至90℃，继续滴加90 mmol（3
‑
氨基丙基）三乙氧基
‑
硅烷，滴加完成后，恒温90℃条件下，持续搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液浓缩到250 mL后，倒入300 mL的四氢呋喃中，2500 rpm离心3分钟，对沉淀洗涤并干燥后，所得白色固体即为POSS
·
8HCl；（二）制备PG1氮气气氛保护条件下，将2 g 上述步骤（一）所制备POSS
·
8HCl、6.93 g Boc
‑
Lys（Boc）
‑
OH、7.71 g HBTU和2.27 g HOBT一起溶解于60 mL的DMF中，溶解完成后，在冰浴条件下再加入9.0 mL DIPEA；30℃条件下，持续搅拌反应48小时；反应结束后，加入250 mL氯仿稀释，并将有机相依次用饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液和1M的HCl洗涤；洗涤完成后，将有机相干燥、适当浓缩后，加入乙腈中进行重结晶得到白色沉淀；分离所得白色沉淀，洗涤、干燥后，所得即为带有氨基保护基团（叔丁基酯）的PG1；
对所得带有氨基保护基团（叔丁基酯）的PG1，加入 TFA进行反应以除去保护保护基团，制备获得PG1；（三）制备PG2氮气气氛保护条件下，将2 g上述步骤（二）所制备PG1、8.7 g Boc
‑
Lys（Boc）
‑
OH、9.6 g HBTU和2.7 g HOBT一起溶解于60 mL的DMF中，溶解完成后，在冰浴条件下再加入11.1 mL DIPEA；30℃条件下，持续搅拌反应48小时；反应结束后，加入250 mL氯仿稀释，并将有机相依次用饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液和1M的HCl洗涤；洗涤完成后，将有机相干燥、适当浓缩后，加入乙腈中进行重结晶得到白色沉淀；分离所得白色沉淀，洗涤、干燥后，所得即为带有氨基保护基团（叔丁基酯）的PG2；对所得带有氨基保护基团（叔丁基酯）的PG2，加入 TFA进行反应以除去保护保护基团，制备获得PG2；（四）制备PG3氮气气氛保护条件下，将2 g上述步骤（三）所制备PG2、8.3 g Boc
‑
Lys（Boc）
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OH、9.1 g HBTU和2.59 g HOBT一起溶解于55 mL的DMF中，溶解完成后，在冰浴条件下再加入10.57 mL DIPEA；30℃条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效胞内递送的氟工程化外泌体，其特征在于，该工程化外泌体是将氟化物通过静电作用和疏水作用结合在外泌体表面制备获得；具体通过如下步骤制备获得：（一）制备获得外泌体所述外泌体为脂肪来源的间充质干细胞AMSCs分泌的外泌体；（二）与FPG3结合将氟化肽类树状分子FPG3与步骤（一）中的外泌体混合均匀后，15~30℃下孵育15~30 min，获得氟工程化外泌体exo@FPG3；以质量比计，氟化肽类树状分子FPG3：外泌体=0.25~20；所述氟化肽类树状分子FPG3，是指氟烃链修饰的赖氨酸树状分子，其分子量为2000~20000。2.如权利要求1所述高效胞内递送的氟工程化外泌体，其特征在于，步骤（一）中，采用超速离心法分离制备获得外泌体，具体制备方法如下：首先，将AMSCs在含有10%胎牛血清的DMEM中培养生长至完全融合；培养结束后，收集培养物，用超速离心法分离获得AMSCs分泌的外泌体，相关操作时均在4℃条件下进行，具体操作如下：先将含有AMSCs的培养基以2000 g离心30 min以去除死细胞和碎片；再将上清液小心地转移到新的离心管中，10000 g离心45 min以分离获得大囊泡；将获得的大囊泡经0.45
ꢀµ
m过滤器过滤后，将得到的上清液100000 g离心70 min，以初步获得外泌体；对所得外泌体用预冷的PBS重悬后，再次100000 g离心70 min以进行纯化。3.如权利要求1所述高效胞内递送的氟工程化外泌体，其特征在于，步骤（二）中，以质量比计，氟化肽类树状分子FPG3：外泌体= 5；所制备的氟工程化外泌体exo@FPG3，表面电位为9.6
ꢀ±ꢀ
0.6 mV。4.如权利要求1所述高效胞内递送的氟工程化外泌体，其特征在于，步骤（二）中，所述氟化肽类树状分子FPG3，以（3
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氨基丙基）三乙氧基
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硅烷合成的 POSS核，以叔丁氧羰基保护的赖氨酸为结构单元，不断经过酰胺缩合以及洗脱保护得到不同代数的肽类树状分子；最后，再对该肽类树状分子进行氟化修饰；具体制备方法如下：（一）制备POSS
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8HCl首先，在50℃条件下，向500 mL无水甲醇中滴加45 mL的浓盐酸；然后，升温至90℃，继续滴加90 mmol（3
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氨基丙基）三乙氧基
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硅烷，滴加完成后，恒温90℃条件下，持续搅拌反应24小时；反应产物即为POSS
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8HCl；（二）制备PG1保护气氛条件下，将2 g上述步骤（一）所制备POSS
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8HCl、6.93 g Boc
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【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一一页附图七页，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：