一种间充质干细胞类外泌体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，极大简化了提取流程，提高了外泌体获得效率；该方法无须收集饥饿处理后细胞培养上清，尽可能减少了外泌体在分泌出来之后于培养基中的降解，可以较为快捷且高效地获得间充质干细胞类外泌体；该提取方法获得的间充质干细胞类外泌体，经过检测，表达外泌体标志性蛋白，电镜下呈典型“杯口”状形态，粒径大小位于30

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞类外泌体的制备方法


[0001]本专利技术属于牙髓间充质干细胞治疗
，具体涉及一种间充质干细胞类外泌体的制备方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞在再生医学中有着重要地位，尤其是治疗慢性炎症性全身性疾病和免疫性疾病方面。随着细胞外囊泡技术的快速发展，间充质干细胞在越来越多的疾病中成为崭露头角的亮点。越来越多的研究支持间充质干细胞的治疗效果是由于旁分泌作用，而不仅仅是通过植入和分化效应进行修复。
[0003]外泌体临床应用的所面临的主要问题是产能不足。差速超离法是用于外泌体分离的第一种方法，至今仍是外泌体分离的金标准，但是长时间的高速离心会造成外泌体的机械损伤，差速超离耗时长，提取率不高，使其难以在短时间内处理多个生物样品。聚合物沉淀法操作简单，所需时间短，适用于处理大量样品，但纯度不高且回收率较低，可能产生假阳性结果，产生的聚合物难以去除。超滤和排阻色谱法是根据外泌体与其他组分的尺寸差异进行分离，免疫亲和法是通过标记外泌体的特异性蛋白来分离，以上两种方法都存在提取效率较低的问题。基于以上原理也出现多个商业化的试剂盒，极大地简化了提取流程，但不同厂商的试剂盒提取效果差异较大。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0006]步骤1：提取牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞是间充质干细胞的一种；
[0007]步骤2：将牙髓间充质干细胞应用人血小板裂解液的α
‑
MEM培养基培养；
[0008]步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞应用超纯水重悬，于2～8℃孵育10～30min,存放入
‑
80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，重复上述过程3～5次；
[0009]步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000～6000g的转速低温离心20～60min，离心后取上清，弃去沉淀，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液；
[0010]步骤5：将步骤4得到的牙髓间充质干细胞裂解液在2～8℃以80000～120000g的转速低温超速离心30～90min，离心后去除上清，以PBS重选沉淀得到外泌体溶液。
[0011]优选的，在步骤1中，将取出的牙髓组织切成1mm3的组织小块，用含有双抗的PBS冲洗3次，然后放入1.5mlEP管中使用中性酶和Ⅰ型胶原酶混合消化20～40min，应用加有人血小板裂解液的α
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MEM培养基中培养，待细胞融合至80％左右后，消化离心，传至第五代。
[0012]优选的，添加的中性酶的质量浓度为0.1％～1％，Ⅰ型胶原酶的的质量浓度为0.1～0.8％；添加双抗为50～100U/mL青霉素和50～150ug/mL链霉素。
[0013]优选的，在步骤2中，牙髓间充质干细胞在添加有人血小板裂解液的α
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MEM培养基中培养36～72h后，更换添加有人血小板裂解液的α
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MEM培养基继续培养，并且在后续培养过程中每36～72小时更换一次培养基。
[0014]优选的，所述添加有人血小板裂解液的α
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MEM培养基中人血小板裂解液的体积浓度为2～10％，这样就避免了传统的胎牛血清中所含的异种抗原成分。
[0015]优选的，在步骤4中，得到的牙髓间充质干细胞裂解液蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。
[0016]优选的，在步骤5中，重悬牙髓间充质干细胞外泌体于PBS中的蛋白浓度为0.8～1.5mg/ml。
[0017]与现有技术相比，本专利技术提供了一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，具备以下有益效果：
[0018]1、该方法从牙髓间充质干细胞裂解液中提取外泌体，极大地提高了获得效率，同时获得外泌体中不含有任何动物源性物质，安全可靠。
[0019]2、本专利技术中获得的类外泌体和内泌体与传统方法提取外泌体通过多种检测相比较，在成分、功能等外面均相同；通过该提取方法获得的外泌体，无论在质还是量上均可以很好地满足临床需求，方便推广应用。
附图说明
[0020]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制，在附图中：
[0021]图1为本专利技术实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体的电镜对比图；
[0022]其中；A：本专利技术提取的类外泌体和内泌体；B：传统方法提取的外泌体；
[0023]图2为本专利技术实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体，外泌体特异性标记蛋白WesternBlot对比图；
[0024]其中；A：本专利技术提取的类外泌体和内泌体；B：传统方法提取的外泌体；
[0025]图3为本专利技术实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体的粒径对比图；
[0026]其中；A：本专利技术提取的类外泌体和内泌体；B：传统方法提取的外泌体；
[0027]图4为本专利技术实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体的蛋白芯片对比图；
[0028]图5为本专利技术实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体，在体外条件下对小鼠成纤维细胞的迁徙性影响的检测示意图；
[0029]图6为本专利技术实施例中提取的类外泌体和内泌体与传统方法提取的外泌体，在体内条件下对小鼠伤口愈合影响的检测示意图。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]请参阅图1
‑
6，本专利技术提供一种技术方案：一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0032]步骤1：提取牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞是间充质干细胞的一种；
[0033]步骤2：将牙髓间充质干细胞应用人血小板裂解液的α
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MEM培养基培养；
[0034]步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞应用超纯水重悬，于2～8℃孵育10～30min,存放入
‑
80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，重复上述过程3～5次；
[0035]步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000～6000g的转速低温离心20～60min，离心后取上清，弃去沉淀，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液；
[0036]步骤5：将步骤4得到的牙髓间充质干细胞裂解液在2～8℃以80000～120000g的转速低温本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞是间充质干细胞的一种；步骤2：将牙髓间充质干细胞应用人血小板裂解液的α
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MEM培养基培养；步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞应用超纯水重悬，于2～8℃孵育10～30min,存放入
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80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，重复上述过程3～5次；步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000～6000g的转速低温离心20～60min，离心后取上清，弃去沉淀，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液；步骤5：将步骤4得到的牙髓间充质干细胞裂解液在2～8℃以80000～120000g的转速低温超速离心30～90min，离心后去除上清，以PBS重选沉淀得到外泌体溶液。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤1中，将取出的牙髓组织切成1mm3的组织小块，用含有双抗的PBS冲洗3次，然后放入1.5mlEP管中使用中性酶和Ⅰ型胶原酶混合消化20～40min，应用加有人血小板裂解液的α
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MEM培养基中培养，待细胞融合至80％左右后，消化离心，传至第五代...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺燕，段星祥，叶青松，朱占永，蒋财磊，
申请(专利权)人：宁波一棵芽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：