无动物源性细胞膜片及其制备方法和应用技术

本公开提供了一种无动物源性(例如无血清)细胞膜片例如间充质干细胞膜片及其制备方法。本公开还提供了该无动物源性(例如无血清)细胞膜片例如间充质干细胞膜片在受损组织的损伤修复中的用途。损伤修复中的用途。

【技术实现步骤摘要】
无动物源性细胞膜片及其制备方法和应用
专利

[0001]本公开涉及组织工程学与再生医学领域，尤其涉及无动物源性细胞膜片及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]与以往的涉及干细胞悬液注射细胞的移植方法相比，细胞膜片是一种更高效的干细胞移植方式。细胞膜片能够有效地避免干细胞在移植过程中的流失，提高干细胞移植效率。此外，细胞膜片在制备过程中不使用酶及类似物进行细胞消化，这有效地避免了酶消化所带来的细胞外基质的破坏和细胞功能减低，细胞膜片移植能使干细胞在体内更好的发挥其功能。
[0003]间充质干细胞膜片制备过程通常涉及将传代培养的间充质干细胞用生物酶消化成单细胞，之后经过清洗以除去间充质干细胞培养基的残留，然后用成膜培养基将细胞重悬后，接种在事先包被好的温度敏感培养皿中。在37℃的培养条件下，细胞在培养皿中贴壁生长，增殖汇合。培养结束后降低培养温度，细胞呈片状自动从温敏表面脱离，即可收获细胞膜片。
[0004]细胞膜片是单层或者多层细胞组成的片状结构。间充质干细胞膜片制备过程中使用的成膜培养基和包被在温度敏感培养皿中的基质残留在细胞间隙及表面，通过外力不易被完全清洗掉。目前已经报道的膜片制备方法中使用的成膜培养基分为三类：含血清培养基、市售无血清培养基和自配无血清培养基。传统血清成膜体系中，血清可以促使细胞在温度敏感培养皿的表面贴附并可以促进细胞与细胞之间的黏连，但含血清培养基中的牛血清含有异源大分子致敏成分牛血清白蛋白，对于临床用途不够安全。无血清培养体系中因缺乏血清，导致细胞不易贴壁，无法形成膜片而呈现破碎状态，或在起膜过程中因膜片韧性不足容易发生破碎(图1)。市面上的间充质干细胞无血清培养基和文献中的自配间充质干细胞无血清培养基为了支持细胞生长，都含有多种外源生长因子，而外源生长因子的残留也会有安全风险。
[0005]此外，目前膜片制备过程中包被基质为纤连蛋白、层粘连蛋白等科研级别试剂，这些试剂在生产过程中不符合GMP标准。
[0006]因此，亟需开发一种使用更安全的成膜培养基和/或更安全的包被基质的制备形态良好、具有韧性的间充质干细胞膜片的方法，从而获得安全性更高、更易于保存和使用的间充质干细胞膜片。

技术实现思路

[0007]为了解决以上技术问题，本公开提供了一种间充质干细胞膜片产品的生产方法。该方法使用的成膜培养基成分简单，包括基础培养基和粘合剂(例如人血清白蛋白(例如药用级别))，其中不含任何动物源性成分(例如血清)和外源生长因子。此外，在细胞膜片制备过程中，可以使用贴壁因子(例如人纤维蛋白原)作为包被基质。
[0008]通过本公开的上述方法制备的间充质干细胞膜片产品更安全，不含有动物源性成分(例如血清)和外源生长因子残留(例如牛血清白蛋白残留量符合药物标准)，成膜过程所用培养基配方简单。此外，本公开的间充质干细胞膜片产品具有一定的韧性，可以在适当的培养基、缓冲液或保存液等中进行折叠和展平。膜片产品在4℃保存在特定的保存液中24小时后仍能够维持良好的膜片形态，细胞存活率高达70％以上，能够分泌高水平的促血管生成因子和抗炎因子，抑制淋巴细胞增殖和炎性因子分泌，能够在临床上用于多种疾病，包括自身免疫系统疾病、器官损伤类疾病，器官移植过程中的排异反应和GVHD等，同时能够维持干细胞特性，具有特定表面标志物，具有三向诱导分化能力，能够在临床上用于受损组织的损伤修复。
[0009]相应的，本公开涉及以下方面。
[0010]在第一个方面，本公开涉及一种制备细胞膜片的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]a.培养和传代细胞；
[0012]b.将所述细胞转移到用基质(又称为贴壁因子)包被的温敏培养皿中，在成膜培养基中培养，从而在培养皿中形成膜片，其中所述成膜培养基包含基础培养基和粘合剂(例如人血清白蛋白)且不包含动物源性成分(例如血清，例如牛血清白蛋白等)和外源生长因子；和
[0013]c.通过降低温度使细胞从所述温敏培养皿脱离。
[0014]本文所用的术语“温度敏感培养皿”或“温敏培养皿”是指表面涂覆了一层温度敏感性高分子物质的培养皿，该高分子物质在不同温度下分子链段的伸展情况不同，从而表现出亲水性或疏水性，使得该高分子物质的亲疏水性能够随外部温度变化而变化。当温敏培养皿表面呈现亲水性时，与细胞及其分泌的细胞外基质粘合性变差，细胞将成层状脱落。在具体应用中，当将温度降低至该高分子物质的低临界溶解温度之下，该温敏培养皿表面呈现亲水性，从而使得细胞将成层状脱落。
[0015]在一些实施方案中，所述细胞膜片是干细胞膜片，例如间充质干细胞膜片。
[0016]在一些实施方案中，所述基质为纤连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、明胶、胶原、玻连蛋白或人纤维蛋白原。在一些实施方案中，所述基质为明胶。在一些实施方案中，明胶的浓度(w/w)为0.01
‑
0.5％，例如0.05
‑
0.2％，例如0.1％。在一些实施方案中，所述基质为玻连蛋白。在一些实施方案中，玻连蛋白的浓度为1
‑
20μg/mL，例如5
‑
15μg/mL，例如10μg/mL。在一些实施方案中，所述基质为多聚D赖氨酸(PDL)。在一些实施方案中，PDL的浓度为0.01
‑
0.5mg/mL，例如0.05
‑
0.2mg/mL，例如0.1mg/mL。用以上基质包被温敏培养皿使得间充质干细胞能够附着于所述培养皿。
[0017]在优选的实施方案中，所述基质为人纤维蛋白原。在一些实施方案中，所述人纤维蛋白原的浓度为0.1
‑
10mg/mL，例如0.2
‑
5mg/mL，例如1
‑
2.5mg/mL。
[0018]在一些实施方案中，在步骤b中，成膜培养基中的基础培养基可以选自DMEM(高糖)、DMEM(低糖)、RPMI1640、α
‑
MEM、DMEM/F12和F12。在一个优选的实施方案中，成膜培养基中的基础培养基为α
‑
MEM。
[0019]在一些实施方案中，在步骤b中，成膜培养基中的人血清白蛋白的浓度为0.1
‑
10％，优选0.1
‑
5％，例如0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。
[0020]在一些实施方案中，在步骤b中，成膜培养基还包含非必需氨基酸(甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
‑
天冬氨酸、L
‑
天门冬酰胺、L
‑
谷氨酸、L
‑
脯氨酸、L
‑
丝氨酸)和/或L
‑
谷氨酰胺。
[0021]在一些实施方案中，在步骤b中使用的成膜培养基中的L
‑
谷氨酰胺的浓度为0.5mM至4mM，优选为约2mM。
[0022]在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备细胞膜片的方法，所述方法包括以下步骤：a.培养和传代细胞；b.将所述细胞转移到用基质包被的温敏培养皿中，在成膜培养基中培养从而在培养皿中形成膜片，其中所述成膜培养基包含基础培养基和人血清白蛋白且不包含动物源性成分和外源生长因子；和c.通过降低温度使细胞从所述温敏培养皿脱离。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞膜片是干细胞膜片，例如间充质干细胞膜片。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基质选自纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、胶原、玻连蛋白和人纤维蛋白原。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基质是多聚D赖氨酸(PDL)。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基质是人纤维蛋白原。6.根据权利要求5所述的方法，所述人纤维蛋白原的浓度为0.1
‑
10mg/mL，例如0.2
‑
5mg/mL，例如1
‑
2.5mg/mL。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中在步骤b中，成膜培养基中的基础培养基选自DMEM(高糖)、DMEM(低糖)、RPMI1640、α
‑
MEM、DMEM/F12和F12，优选为α
‑
MEM。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中在步骤b中，成膜培养基中的人血清白蛋白的浓度为0.1
‑
10％，例如0.1
‑
5％，例如0.5
‑
2％。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中在步骤b中，成膜培养基还包含：(1)甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
‑
天冬氨酸、L
‑
天门冬酰胺、L
‑
谷氨酸、L
‑
脯氨酸和L
‑
丝氨酸，和/或(2)L
‑
谷氨酰胺。10.根据权利要求9所述的方法，其中L
‑
谷氨酰胺的浓度为0.5mM至4mM，优选为2mM。11.根据权利要求9所述的方法，其中甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
‑
天冬氨酸、L
‑
天门冬酰胺、L
‑
谷氨酸、L
‑
脯氨酸和L
‑
丝氨酸各自的浓度为50μM至200μM，优选为100μM。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，其中在步骤a中用于培养和传代的培养基为有血清培养基或补充有一种或多种外源生长因子的无血清培养基。13.根据权利要求12所述的方法，所述无血清培养基选自：RPMI1640、DMEM、α
‑
MEM、DMEM/F12和F12无血清培养基，并且所述外源生...

【专利技术属性】
技术研发人员：常德华，靳新，高爽，王娟，刘帅，赵玉菲，
申请(专利权)人：京东方科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：