一种制备巨噬细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备巨噬细胞的方法，所述方法包括（

【技术实现步骤摘要】
一种制备巨噬细胞的方法


[0001]本专利技术涉及一种制备巨噬细胞的方法，特别是涉及一种从多能干细胞诱导分化巨噬细胞的方法
。
更具体地，本专利技术涉及通过分阶段在不同的特定分化因子存在下体外培养，从胚胎干细胞或者诱导的多能干细胞生产诱导巨噬细胞的方法，以及由此产生的
iMAC
群体及其用途
。

技术介绍

[0002]巨噬细胞是先天免疫反应的关键介质
。
巨噬细胞具有吞噬
、
细胞毒性
、
促炎因子分泌和
T 细胞抗原呈递功能（参考文献
Franken, L., Schiwon, M. & Kurts, C. Macrophages: sentinels and regulators of the immune system. Cell. Microbiol. 18, 475
–
487 (2016)
）
。
巨噬细胞可以通过多种清道夫受体
、
模式识别受体和吞噬受体，感知并响应感染性微生物对组织的侵袭和组织损伤
。
巨噬细胞还具有稳态功能，例如可以清除脂蛋白
、
细胞碎片和死细胞（参考文献
Lavin, Y., Mortha, A., Rahman, A. & Merad, M. Regulation of macrophage development and function in peripheral tissues. Nat. Rev. Immunol. 15, 731
–
744 (2015)
）
。
[0003]人类外周血单个核细胞（
PBMC
）通常用于分离产生巨噬细胞
。
然而，尽管该分离过程相对简单，但很难从不同的供体定期获得大量高质量的细胞
。
因此，人类胚胎干细胞（
hESC
）和诱导的多能干细胞（
iPSC
）被提出作为起始细胞，用于开发包括诱导的巨噬细胞（
iMacrophage
，简称“iMAC”）内的多种细胞谱系
。Ackermann, M
等人的研究表明，
hESC
‑
/iPSC 来源的巨噬细胞可预防急性呼吸道铜绿假单胞菌感染发生，并且可以挽救已建立了肺部感染和严重呼吸功能不全的小鼠（参考文献
Ackermann, M. et al. Bioreactor
‑
based mass production of human iPSC
‑
derived macrophages enables immunotherapies against bacterial airway infections. Nat. Commun. 9, 5088 (2018)
）
。
此外，已有报道表明，表达
CAR
的诱导巨噬细胞具有增强的肿瘤细胞吞噬作用和体内抗癌细胞活性（参考文献
Zhang, L. et al. Pluripotent stem cell
‑
derived CAR
‑
macrophage cells with antigen
‑
dependent anti
‑
cancer cell functions. J. Hematol. Oncol. 13, 153 (2020)
）
。Klichinsky, M
等人的研究也表明，在两种实体瘤异种移植小鼠模型中，载有抗 HER2 CAR
的巨噬细胞可降低肿瘤负荷并延长总生存期；并且在人源化小鼠模型中，
CAR
‑
巨噬细胞能够诱导促炎性肿瘤微环境并增强抗肿瘤
T
细胞活性（参考文献
Klichinsky, M. et al. Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy. Nat. Biotechnol. 38, 947
–
953 (2020)
）
。
与天然巨噬细胞相同，
iMAC
也可以极化为促炎
M1
型或抗炎
M2
型
。
已有报道显示，
M2
型
iMAC
在肝纤维化小鼠模型中可以减少纤维化基因和疾病相关标志物的表达（参考文献
Pouyanfard, S. et al. Human induced pluripotent stem cell
‑
derived macrophages ameliorate liver fibrosis. Stem Cells 39, 1701
–
1717 (2021)
）
。
[0004]因此，
iMAC
是一种有前景的可用于多种疾病的通用型细胞治疗手段
。

技术实现思路

[0005]专利技术要解决的问题
[0006]本专利技术的目的是提供一种制备巨噬细胞的方法，使制备得到的巨噬细胞能够极化为促炎性
M1
表型或抗炎性
M2
表型，同时具有高纯度
、
高吞噬活性和良好的体内持久性
。
[0007]用于解决问题的方案
[0008]本专利技术提供了一种制备巨噬细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]a. 在补充了
CHIR 99021
的培养基中，诱导多能干细胞（
iPSC
）分化成胚状体（
EB
）；
[0010]b. 诱导步骤
a
中形成的
EB
分化成造血干细胞和祖细胞（
HSPC
）；
[0011]c. 诱导步骤
b
中形成的
HSPC
分化为巨噬细胞；
[0012]其中，所述步骤
a
包括：
[0013]（
a1
）在
CHIR 99021
和
Rki
的存在下，在第0天进行诱导；
[0014]（
a2
）在
CHIR 99021
的存在下，在第1天再次进行诱导
。
[0015]优选地，所述步骤
b
包括：
[0016]（
b1
）在补充了
BMP4、FGF2、VEGF
的造血分化培养基中悬浮培养
EB
；
[0017]（
b2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种制备巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了
CHIR 99021
的培养基中，诱导多能干细胞分化成胚状体；
b. 诱导步骤
a
中形成的
EB
分化成造血干细胞和祖细胞；
c. 诱导步骤
b
中形成的
HSPC
分化为巨噬细胞；其中，所述步骤
a
包括：（
a1
）在
CHIR 99021
和
Rki
的存在下，在第0天进行诱导；（
a2
）在
CHIR 99021
的存在下，在第1天再次进行诱导
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤
b
包括：（
b1
）在补充了
BMP4、FGF2、VEGF
的造血分化培养基中悬浮培养
EB
；（
b2
）在补充了
BMP4、SCF、FGF2、VEGF
和
SB431542
的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；（
b3
）在补充了
SCF、FGF2
和
VEGF
的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成
HSPC。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（
a
）是在第0‑1天进行，所述步骤（
b1
）是在第2‑3天进行，所述步骤（
b2
）是在第4‑5天进行，所述步骤（
b3
）是在第6‑7天进行
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述
HSPC
具有
CD34+
表型
。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
c
中所述诱导是将步骤
b
中形成的
HSPC
与巨噬细胞集落刺激因子接触
。6.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤
c
包括：（
c1
）将步骤
b
中形成的
HSPC
加入第一培养基中进行细胞培养；（
c2
）将步骤（
c1
）培养得到的细胞加入第二培养基中进行细胞培养，得到巨噬细胞
。7.
根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一培养基是
X
‑
VIVO15
培养基，补充有
GlutaMAX、P/S、
β
‑
巯基乙醇
、M
‑
CSF
和
IL
‑3中的一种或多种；所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓东，贺智勇，张晓芳，杨果，郑翰，周怡辰，
申请(专利权)人：苏州艾凯利元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：