一种制备制造技术

本发明专利技术涉及一种制备

【技术实现步骤摘要】
一种制备B细胞的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种制备
B
细胞的方法，具体涉及一种诱导
iPSC
来源的造血干细胞分化为
B
细胞的方法
。

技术介绍

[0002]免疫系统的
B
细胞，也称为
B
淋巴细胞，具有产生免疫球蛋白（抗体）的能力，有可能识别所有可能感染的微生物和肿瘤特异性抗原
。B
细胞由骨髓中的造血干细胞（
HSC
）发育而来，在骨髓中发育的第一阶段后在次级淋巴器官中扩增和进一步分化，
B
细胞从中获得抗原特异性和分泌针对所选靶点的抗体的能力
。
[0003]在这个阶段，未成熟的
B
细胞离开骨髓小生境，进入次级淋巴器官，如脾脏和淋巴结
。
在这些区域内，
CD4+T
辅助细胞将抗原呈递给幼稚的
B
细胞，然后
B
细胞在称为生发中心（
GC
）的微观解剖结构中激活并开始一轮又一轮的增殖
、
选择和亲和力成熟
。
一旦选择过程完成，
B
细胞离开
GC
，然后分化为高亲和力抗体分泌细胞（
ASC
）
/
浆细胞或记忆
B
细胞，用于抗原特异性的终身存储
。
[0004]抗体的主要功能是识别并锁住抗原，以便将其从体内清除
。
这一重要功能已在现代医学中被用于开发预防性疫苗，通过刺激免疫系统攻击和消除特定有害物质，从而对其产生积极免疫力
。
然而，在最近几十年中，也开发了用于治疗其他疾病（治疗性疫苗）的疫苗，如实体和血液癌症
。
医学领域的另一个重要应用是单克隆抗体的使用
。
这些是通过基因工程人工产生的，因为它们能够识别几乎任何分子上的单个抗原位点，从药物和激素到微生物抗原和细胞受体
。
[0005]即使最近的技术进步，疫苗和单克隆疗法仍有许多局限性，主要包括效率和可负担性
。
疫苗依赖于接受者的免疫系统发挥作用，通常需要几剂（加强针）来训练身体自卫，免疫反应可能在几个月内减弱
。
另一方面，单克隆抗体的被动免疫具有高的生产成本，因为它需要使用非常大的哺乳动物细胞培养物，然后进行广泛的纯化步骤；在设计足够的药代动力学和组织渗透方面存在困难；在体外可以有各种作用模式，并且一旦在患者体内注射，实际的作用模式并不总是清楚的
。
[0006]一些研究报道了从供体纯化的
CD34+
细胞体外高效分化为
B
细胞，具有与人类循环
B
细胞相同的功能
、
形态和基因表达谱
。
通过利用新的遗传技术，重新编程的人类
B
细胞可以充当细胞工厂，能够输送通过基因编辑引入的持续
、
高剂量的治疗蛋白
。
此外，工程
B
细胞可以为包括感染
、
癌症和自身免疫性疾病在内的多种疾病提供长期治疗
。

技术实现思路

[0007]专利技术要解决的问题
[0008]本专利技术旨在提供一种从
iPSC
衍生的造血干细胞（
CD34+
细胞）分化几种
B
细胞亚群的方法
。
本专利技术的目的将提供一种用于无限期产生
B
细胞的平台，该平台可以进行基因修饰，目的是实现用于治疗多种疾病的确定的单克隆抗体的体内表达
。
[0009]用于解决问题的方案
[0010]本专利技术提供了一种制备
B
细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
[0011]a. 在补充了
CHIR 99021
的培养基中，诱导多能干细胞（
iPSC
）分化成胚状体（
EB
）；
[0012]b. 诱导步骤
a
中形成的
EB
分化成造血干细胞和祖细胞（
HSPC
）；
[0013]c. 诱导步骤
b
中形成的
HSPC
分化为
B
细胞；
[0014]其中，所述步骤
a
包括：
[0015]（
a1
）在
CHIR 99021
和
Rki
的存在下，在第0天进行诱导；
[0016]（
a2
）在
CHIR 99021
的存在下，在第1天再次进行诱导
。
[0017]优选地，所述步骤
b
包括：
[0018]（
b1
）在补充了
BMP4、FGF2、VEGF
的造血分化培养基中悬浮培养
EB
；
[0019]（
b2
）在补充了
BMP4、SCF、FGF2、VEGF
和
SB431542
的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
[0020]（
b3
）在补充了
SCF、FGF2
和
VEGF
的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成
HSPC。
[0021]优选地，所述步骤（
a
）是在第0‑1天进行，所述步骤（
b1
）是在第2‑3天进行，所述步骤（
b2
）是在第4‑5天进行，所述步骤（
b3
）是在第6‑7天进行
。
[0022]优选地，所述
HSPC
具有
CD34+
表型
。
[0023]优选地，所述步骤
c
包括：
[0024]（
c1
）使用
FcVCAM
‑1包被细胞培养板并孵育
。
[0025]优选地，所述
FcVCAM
‑1的浓度为
2.5
ꢀµ
g/mL。
[0026]优选地，所述步骤
c
还包括：
[0027]（
c2
）分离纯化
HSPC
，并在含有
MEM
α
的培养液中培养；
[0028]（
c3
）使用
FcVCAM
‑1包被细胞培养板并孵育；
[0029]（
c4
）收获悬浮细胞，将其在含有
MEM
α
的培养液中重新接种到包被有
FcVCAM
‑1的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种制备
B
细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了
CHIR 99021
的培养基中，诱导多能干细胞（
iPSC
）分化成胚状体（
EB
）；
b. 诱导步骤
a
中形成的
EB
分化成造血干细胞和祖细胞（
HSPC
）；
c. 诱导步骤
b
中形成的
HSPC
分化为
B
细胞；其中，所述步骤
a
包括：（
a1
）在
CHIR 99021
和
Rki
的存在下，在第0天进行诱导；（
a2
）在
CHIR 99021
的存在下，在第1天再次进行诱导
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤
b
包括：（
b1
）在补充了
BMP4、FGF2、VEGF
的造血分化培养基中悬浮培养
EB
；（
b2
）在补充了
BMP4、SCF、FGF2、VEGF
和
SB431542
的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；（
b3
）在补充了
SCF、FGF2
和
VEGF
的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成
HSPC。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（
a
）是在第0‑1天进行，所述步骤（
b1
）是在第2‑3天进行，所述步骤（
b2
）是在第4‑5天进行，所述步骤（
b3
）是在第6‑7天进行
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述
HSPC
具有
CD34+
表型
。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤
c
包括：（
c1
）使用
FcVCAM
‑1包被细胞培养板并孵育
。6.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述
FcVCAM
‑1的浓度为
2.5
ꢀµ
g/mL。7.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤
c
还包括：（
c2
）分离纯化
HSPC
，并在含有
MEM
α
的培养液中培养；（
c3
）使用
FcVCAM
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓东，贺智勇，
申请(专利权)人：苏州艾凯利元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：