双端测序方法和试剂盒技术

本发明专利技术的一种双端测序方法，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有引物的测序芯片中进行扩增，对第一待测模板链进行SBS测序；然后延伸合成获得第二待测模板链；在所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP，然后将所述第二活性基团与位于所述测序芯片表面的第一活性基团进行点击反应，对第二待测模板链进行SBS测序。本发明专利技术的双端测序方法，直接在第一待测模板链测序后扩增延伸第二待测模板链，并将第二待测模板链通过化学键固定于固相表面的进行测序，从而简化了生成固定于固相表面的第二待测模板链的流程，减轻了对芯片基材及DNA的损伤，同时能够降低扩增测序成本。成本。成本。

【技术实现步骤摘要】
双端测序方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于核酸测序
，特别是涉及一种双端测序方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来核酸测序技术发展迅速，主要有第一代测序技术、第二代测序技术和第三代测序技术，而第四代测序技术也在近几年快速发展。核酸测序技术也逐渐变得更加高通量、低成本及多功能。但目前第二代测序技术在全球测序市场仍占有主要地位。第二代测序技术也称为新一代测序技术NGS，基于大规模平行测序技术(massive parallel analysis，MPS)，业内通常称之为高通量测序技术。它能同时完成测序模板互补链的合成和序列信息的获取。相比第一代测序技术，其成本花费更低，一次检测的量更多，测序周期更短。
[0003]目前第二代高通量测序中常用的多核苷酸测序方法包括边合成边测序方法(sequencing by synthesis，SBS)；其主要结合了DNA杂交、聚合酶链式反应等原理和技术，通过涉及引物将待测多核苷酸进行多拷贝，获得待测模板，待测模板链上有特定引物杂交位点，对待测模板处理后杂交上特定引物，通过添加荧光标记的核苷酸后，在聚合酶作用下特定引物3
’
端得以延伸上与模板链互补的核苷酸，核苷酸3
’
端同时可做特定阻断基团修饰以使得一次只能延伸一个核苷酸，在确定所延伸核苷酸种类后，再去除其3
’
端阻断基团和荧光标记基团，得以重新活化并可继续延伸下一个核苷酸，如此循环即可现实对待测链模板链的序列的读取。
[0004]双端测序(paired
‑
end)是高通量测序的重要技术之一。是一种对待测核酸链的正链和反向互补链分别进行测序的技术，如专利US10457985B2、WO2008041002、US20060292611、W006135342、W003074734、US20060024681、US7754429B2等都阐述了相关双端测序方法。其中都借助了固相表面扩增的方法来实现，比如桥式扩增就是一种固相表面扩增方法，该方法是在固相表面上固定两种引物，待测多核苷酸则通过表面上固定的引物进行扩增获得待测多核苷酸分子群或簇(cluster)。该簇最终都是共价固定于固相表面的，且能作为测序模板进行SBS测序。
[0005]专利CN101663405A中阐述了几种实现双端测序的方法，其方法是在固体支持物表面固定两种带有互不相同酶切位点的引物，通过桥式扩增在固体支持物上获得第一模板链和第二模板链，所述第一模板链和第二模板链都是通过5
’
端固定于表面的，选择性切除第二模板链留下第一模板链，且第一模板链可与固相表面固定的引物杂交，对第一模板链进行测序后，需要对表面被切除过的引物修复至再具备延伸活性，然后通过修复后的表面引物再次扩增重新获得第二模板链；选择性去除第一模板链后即可进行第二模板链的测序。但是上述双端测序方法存在的缺点在于：其生成第二模板链的流程复杂，不仅需要对表面被切除过的引物修复至再具备延伸活性，而且需要再次扩增多次循环，才能构建第二模板链进行测序；其中的扩增循环中所用的变性试剂一般为碱或者甲酰胺等破坏性强的试剂，该类试剂的多次使用不但影响测序芯片基材导致表面材料的脱落，而且还会损伤DNA，影响测序结果的准确度。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术提供了一种双端测序方法，能简化测序流程，并保证测序结果的准确度，减少了扩增处理中强破坏性试剂的使用，同时能够降低扩增测序成本。
[0007]本专利技术的第一方面，是提供了一种双端测序方法，包括以下步骤：
[0008]S1，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有固定引物的测序芯片中进行扩增，得到固定于测序芯片表面的待测多核苷酸双链；所述测序芯片表面修饰有第一活性基团，且所述固定引物包括具有互不相同的酶切位点的P5引物和P7引物；
[0009]S2，选择性切除待测多核苷酸双链中的所述P5引物延伸的第二待测模板链，留下的所述P7引物延伸的第一待测模板链，然后对第一待测模板链进行第一次测序；
[0010]S3，以所述第一待测模板链为模板，复制合成出与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链；
[0011]S4，在步骤S3中合成的所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP；将所述第二活性基团与所述第一活性基团进行点击反应，使所述第二待测模板链固定于所述测序芯片表面上；选择性切除所述第一待测模板链，然后对第二待测模板链进行第二次测序。
[0012]在其中一些实施例中，步骤S2中，所述第一次测序包括：采用SP1引物对第一待测模板链进行第一次SBS测序，并得到测序链；
[0013]步骤S3中包括：以所述第一待测模板链为模板，在所述测序链上进行延伸合成延伸链，获得第二待测模板链，所述第二待测模板链依次由SP1引物、测序链和延伸链组成。
[0014]本专利技术的第二方面，是提供了一种双端测序用试剂盒，包括：
[0015]测序芯片，其表面修饰有第一活性基团，且所述测序芯片表面固定有互不相同的酶切位点P5引物和P7引物；
[0016]末端修饰试剂，包括TDT末端转移酶和第二活性基团修饰的dNTP，所述TDT末端转移酶用于所述第二活性基团修饰的dNTP的转移，所述第二活性基团用于与所述第一活性基团产生点击反应形成化学链。
[0017]现有技术中的双端测序方法，对第一模板链进行测序后，需要对表面被切除过的引物修复至再具备延伸活性，然后通过修复后的表面引物再次扩增重新获得固定在固相表面的第二模板链，才能进行第一模板链的测序。为克服生成固定在固相表面的第二模板链中需要进行修复接头和扩增循环等繁琐的流程的问题；本专利技术的一种双端测序方法，将第一待测模板链固定在固相表面进行测序，复制合成出未固定在固相表面的第二待测模板链，然后将第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP，通过第二活性基团与测序芯片表面修饰的第一活性基团进行点击反应形成链接，从而将所述第二待测模板链固定于测序芯片表面以进行测序。本专利技术提出了先复制合成出未固定在固相表面的第二待测模板链，再进行第二待测模板链的固定的测序方法，简化了利用扩增循环手段生成固定于固相表面的第二待测模板链的流程，也减去了修复接头的步骤，简化测序流程，也减少了扩增处理中强破坏性试剂的使用，同时能够降低扩增测序成本，保证测序结果的准确度。
[0018]进一步地，本专利技术在第一待测模板链测序完成后形成的测序链上继续进行延伸合成，得到与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链，即充分利用了测序链，避免使用强破坏性试剂去除测序链导致损伤DNA，从而影响测序结果的准确度，也减少了进一步在测序
链上延伸合成的延伸链长度，提高了第二待测模板链的合成效率。
[0019]进一步地，本专利技术利用化学键将第二待测模板链固定在固相表面，并优选为点击反应形成的链接键，其反应条件简单易于控制，且反应有很强的立体选择性，反应快速、反应效率高，副产物无害，且产物对氧气和水不敏感，不会损害D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双端测序方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有固定引物的测序芯片中进行扩增，得到固定于测序芯片表面的待测多核苷酸双链；所述测序芯片表面修饰有第一活性基团，且所述固定引物包括具有互不相同的酶切位点的P5引物和P7引物；S2，选择性切除待测多核苷酸双链中的所述P5引物延伸的第二待测模板链，留下的所述P7引物延伸的第一待测模板链，然后对第一待测模板链进行第一次测序；S3，以所述第一待测模板链为模板，复制合成出与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链；S4，在步骤S3中合成的所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP；将所述第二活性基团与所述第一活性基团进行点击反应，使所述第二待测模板链固定于所述测序芯片表面上；选择性切除所述第一待测模板链，然后对第二待测模板链进行第二次测序。2.根据权利要求1所述的双端测序方法，其特征在于，步骤S2中，所述第一次测序包括：采用SP1引物对第一待测模板链进行第一次SBS测序，并得到测序链；步骤S3中包括：以所述第一待测模板链为模板，在所述测序链上进行延伸合成延伸链，获得第二待测模板链，所述第二待测模板链依次由SP1引物、测序链和延伸链组成。3.根据权利要求2所述的双端测序方法，其特征在于，所述固定引物通过5
’
端共价固定于测序芯片的表面；和/或，所述步骤S3中合成的所述第二待测模板链的5
’
端至3
’
端依次由SP1引物、测序链和延伸链组成，且所述第二待测模板链通过3
’
端固定到所述测序芯片表面。4.根据权利要求1所述的双端测序方法，其特征在于，所述选择性切除第二待测模板链包括：将所述P5引物的酶切位点进行酶切，然后变性洗脱，将与所述第一待测模板链互补杂交的第二待测模板链去除；和/或，所述选择性切除所述第一待测模板链包括：将所述P7引物的酶切位点进行酶切，然后变性洗脱，将与所述第二待测模板链互补杂交的第一待测模板链去除。5.根据权利要求1所述的双端测序方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆永艺，玄曙光，刘二凯，王谷丰，赵陆洋，
申请(专利权)人：深圳赛陆医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：