一种DNA序列的熔解测定方法及试剂盒技术

本发明专利技术为一种DNA序列的熔解测定方法及试剂盒，其克服了现有链终止测序与合成测序技术中需要大型仪器和专业化的操作，无法实现现场快速检测应用的局限。本发明专利技术熔解测序方法更加简单快速，可广泛用于基于核酸分析的生物医学基础研究、临床诊断、环境监测、食品质量安全检测等领域，具有较强的实际应用价值。方法在聚合酶催化短链DNA延伸反应过程中，一次性引入四种双脱氧核苷酸ddNTP进行链终止反应，或者逐个引入四种dNTP进行链合成反应，反应结束后进行熔解分析，根据所添加的碱基种类以及反应前后的熔解温度(Tm)值的改变，推断链终止反应或合成反应中四种具体碱基的位置，从而准确测定出了短链DNA的序列信息，以此为基础建立了短链DNA序列信息的熔解测定方法。短链DNA序列信息的熔解测定方法。短链DNA序列信息的熔解测定方法。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA序列的熔解测定方法及试剂盒

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[0001]本专利技术属于基于核酸分析的分析生物学检测应用
，涉及一种DNA序列的熔解测定方法及试剂盒。

技术介绍
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[0002]DNA是记录着生命体遗传信息的载体，特定的核苷酸排列顺序储存着生物体的遗传信息，不同生物体具有不同的排列顺序。因其处于分子水平，使得获知其中的奥秘十分不易，目前6只有通过DNA测序技术来实现。DNA测序是指分析特定的DNA片段的碱基序列，也就是胞嘧啶(Cytosine,C)、胸腺嘧啶(Thymine,T)、腺嘌呤(Adenine,A)、鸟嘌呤(Guanine,G)的排列方式。确定序列可以通过比较不同生物体之间的DNA，进而确定不同生物体之间的亲缘关系。DNA序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，极大地推动了医学和生物学的研究与发展。
[0003]链终止测序(Sanger测序)技术是第一代测序技术，由英国的生化学家Sanger专利技术。在Sanger测序中，实现测序的核心是由双脱氧核苷三磷酸(Dideoxyribo nucleoside triphosphate,ddNTP)造成的DNA序列延伸反应终止现象，因此Sanger测序也称为双脱氧链终止法。一般的DNA扩增体系中，包含四种基本成分：模板DNA、引物、脱氧核苷三磷酸(Deoxynucleotide triphosphate,dNTP)、DNA聚合酶。经由热变性处理，DNA双链解旋形成两条寡聚核苷酸单链。经碱基互补配对原则，引物与单链结合。以四种dNTP为原料在DNA聚合酶的催化下，沿5
’
端到3
’
端合成一条与模板单链互补的DNA单链，形成新的DNA双链。Sanger在此基础上加入了新的原料ddNTP。与dNTP相比，虽然ddNTP也能作为原料被DNA聚合酶利用合成DNA链，但ddNTP的3
’
端缺少了一个氧原子，使得其无法与相邻的脱氧核苷酸形成磷酸二脂键，导致DNA链无法顺利合成。dNTP与ddNTP相互竞争，从而产生不同长度的DNA片段。
[0004]随后，高通量DNA测序方法极大地促进了生物学和医学的发展。目前，最广泛使用的测序方法是基于合成测序技术，如Roche/454公司的Pyrosequencing,Illumina公司的Solexa测序，PacBio公司的单分子实时(SMRT)测序。在DNA测序方法中，有两类核苷酸被用作DNA合成的聚合酶底物。一种是天然核苷酸。在焦磷酸测序系统中，在引物延伸过程中引入天然核苷酸，释放的无机焦磷酸(PPi)触发以下步骤，这需要四种酶来实现DNA测序。另一类底物是核苷酸的衍生物，如荧光团标记的核苷酸和二核苷酸。例如，ATP标记的核苷酸已成功用于DNA合成，从而避免了焦磷酸测序方法中从PPi到ATP的过程。荧光团标记核苷酸的引入不仅简化了焦磷酸测序方法的程序，而且通过检测荧光而不是发光来提高灵敏度。
[0005]上述链终止测序和合成测序均已经成熟，但是均需要大型仪器和专业化的操作，难以实现现场快速检测应用。熔解曲线技术是一种用于核酸检测的快速低成本分析方法，可根据熔解曲线分析技术对非特异性扩增进行检测，基于熔解温度的差异，可对引物二聚体和目标DNA进行区分，也可实现单碱基突变的检测，但目前该技术尚未实现DNA序列信息的测定。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的在于提供一种DNA序列的熔解测定方法及试剂盒，其克服了现有链终止测序与合成测序技术中需要大型仪器和专业化的操作，无法实现现场快速检测应用的局限。本专利技术熔解测序方法更加简单快速，可广泛用于基于核酸分析的生物医学基础研究、临床诊断、环境监测、食品质量安全检测等领域，具有较强的实际应用价值。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]1、一种DNA序列的熔解测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0009]1)对10～40nt长度的DNA序列进行单标记、双标记、添加DNA结合染料以及添加小分子季铵盐，经熔解分析后，获取单个碱基长度差异的DNA序列与熔解温度的关系；
[0010]2)对10～40nt长度的DNA序列加入聚合酶和ddNTP进行熔解分析，筛选DNA聚合酶种类，优化酶用量、dNTP浓度、dNTP和ddNTP使用比例实验条件，对25nt的合成DNA序列进行链终止测序，建立短链DNA序列信息的链终止熔解测定方法；
[0011]3)对10nt～40nt的DNA序列逐次添加dNTP进行聚合酶合成反应，每次添加新的dNTP需要采用分离或者酶水解去除上一次未反应的dNTP，熔解分析每次延伸反应产物进行合成测序，建立短链DNA序列信息的合成熔解测定方法。
[0012]步骤1)中，根据荧光变化监测短链DNA信号，通过熔解测定熔解温度与DNA序列长度的相关性；荧光信号输出包括荧光染料EvaGreen，SYTO9，SYBR Green I，核酸分子光开关金属钌配合物，或者荧光标记探针，荧光标记探针单标记或者双标记荧光探针；小分子季铵盐包括四甲基氯化铵，四乙基氯化铵或甜菜碱。
[0013]步骤2)、步骤3)中，DNA聚合酶包括测序酶、Klenowfragment酶、Taq聚合酶、Vent(exo
‑
)DNA聚合酶、Bst聚合酶或反转录酶。
[0014]步骤2)中，聚合酶用量优化范围为0～1.5U，dNTP浓度范围为0.2～2000μmol/L，dNTP和ddNTP使用比例范围为1:0.5～1:2。
[0015]步骤3)中，经由超滤、磁珠分离、水解酶或乙醇沉淀方法除去多余的未结合到DNA链上的dNTP。
[0016]一种DNA序列的熔解测定方法所采用的试剂盒，其特征在于：试剂盒中包括用于测定序列信息的DNA探针、1
×
的反应buffer：DNA聚合酶、100mM的dNTP、10mM的ddNTP。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有的优点和效果如下：
[0018]1、本专利技术利用熔解分析来进行链终止反应产物的鉴别及链终止测序，不需要专门的平板/毛细管凝胶电泳或者质谱设备即可实现DNA序列的快速测定，避免了繁琐的制胶、样品转移分离以及专业操作等步骤。
[0019]2、本专利技术利用熔解分析来进行DNA延伸反应产物的鉴别及合成测序，不需要类似二代测序大型仪器设备及专用配套试剂耗材即可实现DNA序列的快速测定，具有现场快速检测应用的潜力。
[0020]3、对于熔解分析中因熔解温度值相近无法区分的目标DNA，无需重新设计合成引物，通过加入ddNTP进行链终止熔解测序或者加入dNTP进行合成熔解测序即可有效进行鉴别区分。
附图说明：
[0021]图1单碱基长度差异的DNA熔解测定。其中：(a)EvaGreen染料；(b)SYTO9染料；(c)SYBR Green I；(d)双标记探针；(E)单标记探针；(F)添加小分子季铵盐。
[0022]图2为链终止熔解测定短链DNA序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA序列的熔解测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1)对10～40nt长度的DNA序列进行单标记、双标记、添加DNA结合染料以及添加小分子季铵盐，经熔解分析后，获取单个碱基长度差异的DNA序列与熔解温度的关系；2)对10～40nt长度的DNA序列加入聚合酶和ddNTP进行熔解分析，筛选DNA聚合酶种类，优化酶用量、dNTP浓度、dNTP和ddNTP使用比例实验条件，对25nt的合成DNA序列进行链终止测序，建立短链DNA序列信息的链终止熔解测定方法；3)对10nt～40nt的DNA序列逐次添加dNTP进行聚合酶合成反应，每次添加新的dNTP需要采用分离或者酶水解去除上一次未反应的dNTP，熔解分析每次延伸反应产物进行合成测序，建立短链DNA序列信息的合成熔解测定方法。2.根据权利要求1所述的一种DNA序列的熔解测定方法，其特征在于：步骤1)中，根据荧光变化监测短链DNA信号，通过熔解测定熔解温度与DNA序列长度的相关性；荧光信号输出包括荧光染料EvaGreen，SYTO9，SYBR Green I，核酸分子光开关金属钌配合物，或者荧光标...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，王芳，汪瑞，李国梁，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：