一种单碱基水平检测基因组DNA上N4-mC及5mC修饰的测序方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测DNA分子中5mC及N4‑

【技术实现步骤摘要】
一种单碱基水平检测基因组DNA上N4‑
mC及5mC修饰的测序方法


[0001]本专利技术属于测序领域，具体地涉及甲基化的检测方法。

技术介绍

[0002]原核生物中的DNA甲基化修饰是一种保护细菌DNA免受噬菌体外源DNA侵害的方法，该防御机制被称为限制性修饰系统(Restriction and Modification Systems，简称R
‑
M系统)。R
‑
M系统是指细菌基因组DNA在自身甲基转移酶的作用下，在特定位点发生甲基化修饰，而未甲基化的DNA将被同源限制性内切酶切割。R
‑
M系统由两个部分组成：DNA甲基转移酶和限制性内切核酸酶，甲基转移酶对DNA的特定部分进行甲基化修饰，而限制性核酸内切酶则根据序列切割DNA。由于R
‑
M系统由限制性和修饰性系统组成，因此它们可以有效区分“自身”和“非自身”DNA，以限制外源或噬菌体感染，该机制在原理上类似于先天免疫应答。
[0003]研究人员通过对200多种不同的细菌和其他原核生物，例如古细菌等研究发现，超过90％的原核生物中都存在DNA甲基化，并且有600多种甲基转移酶，表明存在大量的甲基化修饰多样性。研究还观察到了许多其他的DNA甲基化模式(甚至包含没有限制性内切系统)。这表明DNA甲基化在原核生物中参与基因组调控，并在原核生物的生理生化中有着至关重要的作用，如调节毒力、抗生素耐药性，及适应氧化、缺氧、营养匮乏、酸性pH等环境。不仅如此，DNA的甲基化修饰还可能和基因表达的表观遗传调控有关。DNA甲基化通过直接的原子空间位阻效应，或者间接改变DNA结构进而降低双螺旋结构的热力学稳定性，从而改变DNA与调控蛋白质之间的相互作用，导致基因表达产生差异。同时，一些DNA结合蛋白也会抑制特定DNA序列的甲基化，例如通过与非甲基化DNA以高亲和力结合，从而保护特定DNA不被甲基化。
[0004]N6‑
Methyladeniine(N6‑
甲基腺嘌呤，简称6mA)，5
‑
methylcytosine(5
‑
甲基胞嘧啶)(5mC)是细菌中常见的两种DNA修饰。随后在20世纪80年代，在一些细菌中还发现了N4‑
methylcytosine(N4‑
甲基胞嘧啶，简称N4‑
mC)。与6mA和5mC类似，N4‑
mC也参与细菌R
‑
M系统，保护细菌免受噬菌体和其他外来入侵DNA的伤害。研究进一步发现，N4‑
mC修饰在DNA复制、细胞周期和调节基因表达等方面起着重要作用，并参与基因组的稳定、重组和进化。然而，N4‑
mC对基因调控的详细机制以及作用一直不清楚，这主要是由于缺乏单碱基水平检测基因组中N4‑
mC的有效方法。揭示N4‑
mC在基因组中的功能依赖于N4‑
mC在基因组中的灵敏检测、精确定量和定位。
[0005]质谱法目前已经成为定性和定量分析核酸修饰的有效技术，但依然无法检测DNA修饰所在的序列信息。单分子实时测序(SMRT)技术能够分析用于整个基因组组装的数据，同时能够检测所有N4‑
mC和6mA等碱基修饰，但是准确率仍有待提高。同时，与Illumina测序系统等常用的二代测序技术相比，SMRT测序对于文库制备和测序来说成本更高，因此它并不是分析大样本中DNA甲基化的可行解决方案。因此，建立与二代测序平台兼容的N4‑
mC特异性检测方法是非常重要的，以此来促进许多未表征但可能有用的菌株中N4‑
mC的分布及
其功能的研究。
[0006]亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing)能够以单碱基分辨率识别基因组中的碱基修饰位点。然而传统的亚硫酸氢盐测序因为N4‑
mC的部分抵抗脱氨作用导致复杂的测序结果，不适合准确区分N4‑
mC和5mC。N4‑
mC
‑
Tet辅助的亚硫酸氢盐测序(N4‑
mC
‑
Tet
‑
assisted
‑
bisulfite
‑
sequencing)技术，利用Tet氧化5mC生成5caC，再经亚硫酸氢盐处理后，胞嘧啶(C)和5mC都被读为胸腺嘧啶，而只有N4‑
mC被读为胞嘧啶，以此来揭示了它们在整个基因组中的特定位置。但基因组中5mC一般比N4‑
mC含量高，且TET氧化反应不完全会导致较多的假阳性，另外纯化酶活高的TET蛋白成本也较高。
[0007]4mC
‑
AMD
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seq技术，利用胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白对DNA中正常的胞嘧啶(C)和5mC进行脱氨基，随后在后续聚合酶链式反应中扩增形成胸腺嘧啶(T)，而目标分析物N4‑
mC能够抵抗胞嘧啶脱氨酶A3A的脱氨作用，因此，在随后的聚合酶链式反应中扩增为胞嘧啶(C)。这样，只有N4‑
mC才能在最终的测序中被读为胞嘧啶(C)。但基因组中C及5mC一般比N4‑
mC含量高很多，A3A蛋白对C或5mC的脱氨基不完全，会导致较多的假阳性。
[0008]因此，开发在单碱基水平检测基因组DNA中的5mC及N4‑
mC修饰位点并加以区分是本领域亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术通过利用AlkB蛋白或其变体对DNA进行处理，然后经亚硫酸氢盐测序比较经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子和未经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子的测序结果，从而区分5mC和N4‑
mC位点。
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种用于检测DNA分子中5mC及N4‑
mC修饰位点的方法，所述方法包括用AlkB蛋白或其变体处理所述DNA分子的步骤。
[0011]第二方面，本专利技术提供了一种用于DNA分子测序的方法，所述方法包括用AlkB蛋白或其变体处理所述DNA分子的步骤。
[0012]在一些实施方案中，所述第一方面和第二方面的方法包括以下步骤：
[0013](1)用AlkB蛋白或其变体处理所述DNA分子；以及
[0014](2)用亚硫酸氢盐处理经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子，和未经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子。
[0015]在一些实施方案，所述第一方面和第二方面的方法还包括对步骤(2)获得的用亚硫酸氢盐处理的经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子，以及用亚硫酸氢盐处理的未经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子进行测序的步骤。
[0016]在一些实施方案中，所述测序为Sanger测序或者第二代高通量测序(Next generation sequencing)。
[0017]在一些实施方案，所述第一方面和第二方面的方法还包括对测序结果中的5mC和N4‑
mC位点进行鉴定的步骤。
[0018]在一些实施方案中，如果一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测DNA分子中5mC及N4‑
mC修饰位点的方法，所述方法包括用AlkB蛋白或其变体处理所述DNA分子的步骤。2.一种用于DNA分子测序的方法，所述方法包括用AlkB蛋白或其变体处理所述DNA分子的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包括以下步骤：(1)用AlkB蛋白或其变体处理所述DNA分子；以及(2)用亚硫酸氢盐处理经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子，和未经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子。4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括对步骤(2)获得的用亚硫酸氢盐处理的经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子，以及用亚硫酸氢盐处理的未经AlkB蛋白或其变体处理的DNA分子进行测序的步骤，优选地，所述测序为Sanger测序或者第二代高通量测序。5.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括对测序结果中的5mC和N4‑
mC位点进行鉴定的步骤。6.根据权利要求1或2所述的方法，如果一个位点在AlkB处理前后的测序结果均为C，则该位点为5mC；如果一个位点在AlkB处理前测序结果为C，在AlkB处理后测序结果为T，则该位点为N4‑
mC位点。7.根据权利要求1或2所述的方法，所述DNA分子选自：基因组DNA，优选核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA；质粒DNA、游离DNA或获自单链核酸样品，优选DNA、cDNA；和/或，λ噬菌体和其他微生物中的DNA。8.根据权利要求1或2所述的方法，所述DNA分子可以通过富集或者通过染色质免疫沉淀获得。9.根据权利要求1或2所述的方法，所述DNA分子的样品可以来自生物样品、环...

【专利技术属性】
技术研发人员：李筝，韩露，李依娜，王胜兰，王洁，
申请(专利权)人：广州国家实验室，
类型：发明
国别省市：