一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗及其制备方法与应用，所述鲑鱼甲病毒DNA疫苗包括含有鲑鱼甲病毒结构蛋白的基因片段和大菱鲆分子佐剂CpG

【技术实现步骤摘要】
一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)是一种单股正链RNA病毒，迄今为止发现的鲑鱼甲病毒共有6种基因型。在分类上属于披膜病毒科(Togaviridae)、甲病毒属(Alphavirus)。对大西洋鲑(Salmo salar)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等鲑科鱼类的临床症状有宿主胰腺、心肌炎症和厌食昏睡等，致死率从1％
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48％不等，在养殖鱼类的各个生长阶段都有爆发。我国每年需要进口大量的鲑鱼以供食用，以大西洋鲑鱼为主要代表。
[0003]大菱鲆，又名多宝鱼(Turbot)。根据国家海水鱼产业技术体系2019年调查数据显示，截至2019年底，体系示范区的大菱鲆产量总计62952.56吨，产量最高的辽宁省大菱鲆年产量占总产量的67.13％。在大菱鲆的养殖过程中，经常受到病毒性病害的威胁。鲑鱼甲病毒SAV对其具有极高的致病性，可造成大菱鲆的高死亡率。
[0004]目前，国内外对于鲑鱼甲病毒SAV的有效治疗手法尚无报道，民间多采用保守性的预防措施为主，例如科学饲养、及时消毒等。因此，对于鲑鱼甲病毒SAV造成的经济损失仍未得到有效的止损。
[0005]因此，迫切需要研制出一种能有效预防针对鲑鱼甲病毒SAV爆发的疫苗，寻求新的治疗手法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是为了克服现有技术中仍无法防治鲑鱼甲病毒SAV的缺陷而提供一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗及其制备方法与应用。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]本专利技术的技术方案之一为提供一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗，包括含有鲑鱼甲病毒结构蛋白的基因片段和大菱鲆分子佐剂CpG
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ODN基因片段的质粒，所述结构蛋白基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述大菱鲆分子佐剂CpG
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ODN基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术的技术方案之二为提供一种如技术方案之一所述鲑鱼甲病毒DNA疫苗的制备方法，包括：
[0010]将鲑鱼甲病毒结构蛋白的基因片段、大菱鲆分子佐剂CpG
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ODN基因片段与载体重组，构建重组表达质粒，得到的重组质粒即为鲑鱼甲病毒DNA疫苗。
[0011]进一步地，在一些具体实施方式中，所述载体为真核表达载体。
[0012]更进一步地，在一些具体实施方式中，所述真核表达载体为带CMV真核启动子的真核表达质粒。
[0013]更进一步地，在一些具体实施方式中，所述真核表达载体为pCDNA3.1(+)。
[0014]本专利技术的技术方案之三为提供一种如技术方案之一所述鲑鱼甲病毒DNA疫苗的应用，所述鲑鱼甲病毒DNA疫苗用于防治养殖鱼类的病毒感染。
[0015]进一步地，在一些具体实施方式中，所述养殖鱼类包括大菱鲆、鲑科鱼类。
[0016]更进一步地，在一些具体实施方式中，所述大菱鲆通过胸鳍基部注射方式进行给药。
[0017]更进一步地，在一些具体实施方式中，所述给药体积为80～200μL/尾。
[0018]更进一步地，在一些具体实施方式中，所述给药体积为100μL/尾。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]本专利技术制备的针对鲑鱼甲病毒病的DNA疫苗能显著引起鱼体内相关的特异性和非特异性免疫反应，对大菱鲆免受该病毒感染起到良好的预防作用，可为后期DNA疫苗在生产应用及产业化生产中提供理论基础和科学依据。
附图说明
[0021]图1为鲑鱼甲病毒SAV 4640基因结构示意图。
[0022]图2为鲑鱼甲病毒DNA疫苗pcDNA3.1(+)
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SP
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CpG的重组质粒图谱。
[0023]图3为鲑鱼甲病毒DNA疫苗的PCR检测结果图，其中，a图为SP基因片段的验证，b图为CMV启动子片段的验证。
[0024]图4为大菱鲆分子佐剂CpG DNA序列的示意图。
[0025]图5为血清中和抗体效价的结果图。
[0026]图6为免疫相关基因的表达分析结果图；图中，A为肝脏中白细胞介素
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1β的检测结果图，B为脾脏中白细胞介素
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1β的检测结果图，C为头肾中白细胞介素
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1β的检测结果图，D为肝脏中白细胞介素
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10的检测结果图，E为脾脏中白细胞介素
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10的检测结果图，F为头肾中白细胞介素
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10的检测结果图，G为肝脏中肿瘤坏死因子
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α的检测结果图，H为脾脏中肿瘤坏死因子
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α的检测结果图，I为头肾中肿瘤坏死因子
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α的检测结果图，J为肝脏中抗病毒基因的检测结果图，K为脾脏中抗病毒基因的检测结果图，L为头肾中抗病毒基因的检测结果图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。本实施例以本专利技术技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。
[0028]以下各实施例和对比例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。
[0029]实施例1：
[0030]1.1材料
[0031]鲑鱼甲病毒(SAV)结构蛋白(Structure Protein,SP)基因片段：人工合成，来源于鲑鱼甲病毒SAV 4640，其GenBank为JX163854。
[0032]健康的大菱鲆：来自山东烟台市一大菱鲆养殖场。
[0033]1.2构建pCDNA3.1(+)
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CpG的重组质粒
[0034]将大菱鲆CpG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN 1668和CpG ODN 205依次串联后再将其组成的序列拷贝四次得到整个富含CpG基序的CpG DNA序列，如SEQ ID NO.2和图4所示。随后将CpG DNA序列两端加上Bam H和Eco RI两个酶切位点。整个CpG DNA序列由南京金斯瑞公司合成，并用Bam H和Eco RI对pcDNA3.1(+)质粒上进行双酶切并回收纯化，后将两者进行连接，得到最终富含CpG基序的重组质粒pcDNA3.1(+)
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CpG，也为pCpG佐剂。
[0035]CpG DNA序列(SEQ ID NO.2)：
[0036]TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTTTCCATGACGTTCCTGATGCTGATCGCGTGCGTGCGTCTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲑鱼甲病毒DNA疫苗，其特征在于，包括含有鲑鱼甲病毒结构蛋白的基因片段和大菱鲆分子佐剂CpG
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ODN基因片段的质粒，所述结构蛋白基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述大菱鲆分子佐剂CpG
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ODN基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种如权利要求1所述的鲑鱼甲病毒DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括：将鲑鱼甲病毒结构蛋白的基因片段、大菱鲆分子佐剂CpG
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ODN基因片段与载体重组，构建重组表达质粒，得到的重组质粒即为鲑鱼甲病毒DNA疫苗。3.根据权利要求2所述的鲑鱼甲病毒DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述载体为真核表达载体。4.根据权利要求3所述的鲑鱼甲病毒DNA疫苗的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宵，王启要，马悦，刘晓红，邵帅，王卓，张博雅，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：