一种猫杯状病毒灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术首次从衡阳地区分离得到一株猫杯状病毒FCV

【技术实现步骤摘要】
一种猫杯状病毒灭活疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种猫杯状病毒灭活疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]猫杯状病毒（feline calicivirus，FCV）属于杯状病毒科、水疱疹病毒属，是一种高度流行的家猫病原体，常与猫疱疹病毒合并感染病引起猫科动物口腔与上呼吸道疾病。FCV 在猫科动物中具有高度传染性，不仅在世界各地的猫群中广泛存在，还可以感染老虎、猞猁等野生猫科动物，对宠物猫的生命和野生猫科动物的生物多样性产生严重威胁。经典 FCV 主要致猫的上呼吸道感染，主要表现为口腔粘膜、齿龈、舌表面发生糜烂和溃疡，体温轻微升高、流鼻涕和上呼吸道症状，病死率很低，但感染率很高。在猫群中，感染率可高达90% 以上。
[0003]猫杯状病毒（Feline calicivirus， FCV）为杯状病毒科疱疹病毒属的单股正链 RNA 病毒，由于 RNA 依赖 RNA 聚合酶在病毒复制过程中的不稳定性，FCV 在免疫压力下极易突变产生多样性毒株。过去 50 多年，猫杯状病毒在免疫压力下随着时间推移突变出多种可引起猫不同临床特征的新毒株，从传统的引起口腔溃疡和上呼吸道症状的毒株，逐渐突变出现引起猫严重下呼吸道症状如肺炎的高致病性毒株、引起猫跛行的毒株和引起猫毒性系统性疾病的毒株等。近年来越来越多的 FCV 在中国被不断分离和报道，2018 年郭慧敏等首次报道了 VS
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FCV 中国分离株，其研究结果显示FCV 在中国已经发生了明显的变异，出现了超强毒株，利用传统的 FCV疫苗并不能对抗该病毒的感染，对中国 FCV 引起的疫病防控带来了新的难题。FCV 是一种基因组易发生变异的 RNA 病毒，这种变异不仅表现在抗原性方面，而且体现在致病性增强方面。临床上疫苗预防效果并不理想，尤其是与高致病性 FCV 的交叉免疫很少，导致临床上免疫失败频发。FCV部分感染猫康复后仍会继续排毒，持续时间为30天至数年不等。有报道显示，2005年欧洲 FCV 横向流调感染率为20
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40%，FCV 纵向流调结果显示感染率为30
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75%。
[0004]目前FCV的防治仍以疫苗预防为主，修饰的活疫苗和灭活疫苗是可及的，主要基于毒株FCV F9或FCV 255，然而，以上毒株都是较为传统的毒株，缺乏广泛的交叉保护，当然采用二联苗的方式可以使得保护更加有效，例如采用FCV431和FCV G1。而目前国内尚无商品化的疫苗，FCV 的预防主要依赖于进口猫三联疫苗。FCV虽然只有一个血清型，但由于商品疫苗的使用和FCV的变异，毒株件差异较大，野毒株与减毒活疫苗F9件的交叉反应逐渐变弱，现有的疫苗对当下流行的毒株的防控能力有限，疫苗免疫失败现行时有发生，国内也逐步开展了毒株的分离和疫苗的制备相关工作，例如专利申请CN202111402965X即报道了分离得到一种猫杯状病毒毒株，并将其制备成灭活疫苗；CN202210586650.3也报道获得了一株猫杯状病毒FCV
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H株，制成疫苗后可以刺激动物产生高水平的IgG和IgM抗体。王洁等（动物医学进展，2021,42（8））也分离得到了一株猫杯状病毒。因此，流行毒株的分离，针对流行毒株制备疫苗、卵黄抗体，对于猫杯状病毒导致的疾病的防控、治疗具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]为了解决以上技术问题，本专利技术分离得到一株新的猫杯状病毒毒株，并将其制备得到灭活疫苗，经动物实验表明，所述毒株能够刺激免疫对象产生较高滴度的中和抗体，攻毒保护作用较好，对于猫杯状病毒感染的预防具有积极的作用。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种猫杯状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗是由猫杯状病毒FCV
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HY220313株经灭活制备得到，所述猫杯状病毒FCV
‑
HY220313的微生物保藏编号为CCTCC NO:V202287。
[0007]所述猫杯状病毒灭活疫苗中病毒含量≥10
8.00
TCID
50
/ml。
[0008]所述猫杯状病毒经BEI灭活。
[0009]所述猫杯状病毒灭活疫苗中还包括佐剂。
[0010]所述佐剂为ISA206佐剂。
[0011]所述猫杯状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一，病毒的增殖；步骤二，病毒的灭活；步骤三，灭活疫苗的配制。
[0012]优选地，所述病毒的增殖包括如下步骤：步骤a. 培养猫肾传代细胞F81，生长液为含5%胎牛血清、含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL的MEM，在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基。
[0013]步骤b. 取含量为1
×
105TCID
50
/ml 的猫杯状病毒FCV
‑
HY220313株按2%的体积百分比接种到步骤a制备得到的生长状态良好的F81单层细胞，37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM作为维持液继续培养；步骤c. 接毒后，每日观察3次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，
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80℃反复冻融三次，8000 rpm离心15min，收集上清液，即为FCV
‑
HY220313株病毒培养液。
[0014]优选地，所述病毒的灭活包括如下步骤：步骤d. 将FCV
‑
HY220313株病毒培养液稀释至病毒含量为2
×
10
8.00
TCID
50
/ml，加入终浓度为0.002mol/L 的BEI，30℃下灭活24h后，加入终浓度为0.002mol/L 的硫代硫酸钠中和BEI，得到灭活的疫苗原液。
[0015]优选地，所述灭活疫苗的配制包括如下步骤：步骤e. 将猫杯状病毒FCV
‑
HY220313株疫苗原液和ISA206佐剂按照体积比为1:1混合，在无菌环境中搅拌均匀，在乳化机内乳化5min，分装于透明玻璃瓶内，即制得所述灭活疫苗。
[0016]基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术首次从衡阳地区分离得到一株猫杯状病毒FCV
‑
HY220313毒株，经测序与分析， FCV
‑
HY220313毒株与HZ2063、DL39、BJ
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112和BJ
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281等中国分离毒株亲缘关系最近、同属于ClusterⅢ，将其采用BEI灭活后与佐剂组合制备得到灭活疫苗，该疫苗具有良好的免疫原性，相对现有的商品疫苗能够更好地刺激机体产生中和抗体。经攻毒试验表明，FCV灭活疫苗免疫后可保护机体防御病毒攻击，有效减轻攻毒后症状，降低攻毒后评分，缩短病程，然而，FCV
‑
HY220313株灭活疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫杯状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗是由猫杯状病毒FCV
‑
HY220313株经灭活制备得到，所述猫杯状病毒FCV
‑
HY220313的微生物保藏编号为CCTCC NO:V202287。2.根据权利要求1所述的猫杯状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述猫杯状病毒灭活疫苗中病毒含量≥10
8.00
TCID
50
/ml。3.根据权利要求1所述的猫杯状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述猫杯状病毒经BEI灭活。4.根据权利要求1所述的猫杯状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述猫杯状病毒灭活疫苗中还包括佐剂。5.根据权利要求4所述的猫杯状病毒灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为ISA206佐剂。6.一种制备权利要求1
‑
5任一项所述的猫杯状病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一，病毒的增殖；步骤二，病毒的灭活；步骤三，灭活疫苗的配制。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒的增殖包括如下步骤：步骤a. 培养猫肾传代细胞F81，生长液为含5%胎牛血清、含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL的MEM，在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS洗涤1次后更换为无血清培养基；步骤b. 取含量为1
×
105TCID
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐青海，喻正军，刘婷，石建，胡意，蔡行，刘会敬，曾沛暄，吴瑶燕，杨灿，唐斯萍，杨海，王芳宇，
申请(专利权)人：湖南中净生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：