用于用病毒感染细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高生物反应器中来自宿主细胞的病毒、病毒颗粒或病毒载体的产量的方法。本发明专利技术提供了一种确定和控制宿主细胞感染的最佳时间的可重复且稳健的方法和系统，该方法和系统使用过程空气参数(包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性，从而提高病毒产量。从而提高病毒产量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于用病毒感染细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年10月23日提交的美国临时申请序列号63/104,803的权益，其据此通过引用以其整体并入本文，包括任何图、表格、核酸序列、氨基酸序列或附图。


[0003]本专利技术涉及一种用于疫苗和病毒载体制造的病毒和病毒载体的繁殖方法。更具体地，本专利技术涉及一种用于引发导致在固定床(fixed
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bed)生物反应器中宿主细胞病毒产量增加的宿主细胞感染的特定方法。

技术介绍

[0004]允许病毒和病毒载体可重复和稳健生产以满足对疫苗和其他疗法不断增长的需求的稳健技术是必不可少的。此外，对于多功能宿主细胞技术平台(诸如Vero细胞和其他哺乳动物细胞平台、禽细胞平台和昆虫细胞技术平台)的开发，提高来自宿主细胞的病毒产量的技术在加速疫苗过程和生产的开发中也发挥重要作用。本专利技术满足了改进病毒生成方法的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的实施方案提供了利用空气流和O2流参数来确定在固定床和其他生物反应器系统中扩增的宿主细胞的最佳感染时间的系统和方法，在固定床和其他生物反应器系统中细胞计数采样是困难的、不切实际的或不可能的。
[0006]使用代谢物数据来确定固定床反应器中相对于细胞密度的最佳感染时间的已知方法需要采样和宽泛的感染窗口。通过观察过程空气参数，包括将反应器内的总空气流与O2流进行比较，本专利技术人已经确定了感兴趣的因素、参数和趋势，包括进入固定床反应器的空气流的体积减少并与进入反应器的O2流体积的增加趋势交叉的趋势。本专利技术提供了一种确定和控制宿主细胞最佳感染时间的可重复且稳健的过程，该过程使用过程空气参数(包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性，从而提高病毒产量。本文公开的数据支持空气/O2趋势以及与反应器内细胞密度的相关性。
附图说明
[0007]本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本在请求并支付必要的费用后将由专利商标局提供。
[0008]图1比较了根据本专利技术实施方案的两次代表性运行的空气流和氧气(O2)流。
[0009]图2绘制了根据本专利技术实施方案的空气
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O2差与UNVC活细胞密度的图表。
[0010]图3绘制了根据本专利技术实施方案的平均每小时空气
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O2差与活细胞密度随时间的变化。
[0011]图4图示了根据本专利技术实施方案应用于图1中的代表性运行2的空气
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O2差模型。
[0012]图5A图示了固定床生物反应器中使用的微载体条，13个微载体条(每条3维面积为约11.2cm2)显示在5mL培养基中。
[0013]图5B图示了可以用于每个床容纳最多3,500条的生物反应器的横截面。
[0014]图5C以横截面图图示了生物反应器的不同部分。
具体实施方式
[0015]本专利技术提供了用于确定和控制宿主细胞最佳感染时间的可重复且稳健过程的系统和方法，该系统和方法使用过程空气参数(包括空气流、O2流及其各自的趋势)的相关性，从而提高病毒产量。
[0016]在一个实施方案中，本专利技术提供了一种在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染宿主细胞的方法，其包括以下步骤：在生物反应器中培养宿主细胞；观察一组生物反应器过程空气参数；基于生物反应器过程空气参数识别第一时间标记；基于第一时间标记计算感染窗口的最佳时间；以及在所计算的感染窗口的最佳时间期间感染宿主细胞。
[0017]符合现行良好生产规范(CGMP)的设备可能没有配备细胞计数。本专利技术的优点是，它提供了一种过程，其允许过程基于空气流和氧气流的相关性进行监测以开始最佳感染时间，而不是基于或附加地基于时间、细胞计数或细胞计数的替代物(诸如生物量)。
[0018]在某些实施方案中，宿主细胞可以包括贴壁细胞。在某些实施方案中，生物反应器可以是固定床生物反应器。在某些实施方案中，观察生物反应器过程空气参数的步骤包括在多个时间点，测量进入生物反应器的总空气流的速率和测量进入生物反应器的O2流的速率，以在每个相应的时间点创建当前测量组。在某些实施方案中，识别第一时间标记的步骤包括确定进入生物反应器的总空气流的速率降低并与进入生物反应器的O2流的速率的增加趋势交叉的时间。在某些实施方案中，识别第一时间标记的步骤包括计算来自一个或多个当前测量组的一个或多个值，以预测进入生物反应器的总空气流的速率预期降低并与进入生物反应器的O2流的速率的预期增加趋势交叉的未来时间。
[0019]任选地，一旦为特定细胞系和病毒建立了感染窗口，就可以将建立的感染窗口应用于其他病毒并与其他病毒一起使用。然而，可能仍然需要监测进入生物反应器的总空气流和进入生物反应器的O2流的速率，以便进行主动监测以收集数据和进行实时过程控制。
[0020]本专利技术中用于培养病毒的宿主细胞的类型可以是天然的或基因修饰的(例如，重组细胞、细胞系等)，并且可以是适于生产病毒抗原、病毒载体或病毒产品的任何真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是Vero细胞，并且病毒是病毒载体诸如重组水疱性口炎病毒(rVSV)。
[0021]在一些实施方案中，感染窗口的最佳时间的确定基于过程空气参数的相关性，包括但不限于空气流、O2流及其收敛、它们之间的关系(例如，两者之间的比率)或其各自的趋势，从而提高病毒产量。在一些实施方案中，感染窗口的最佳时间是空气流和O2流的收敛。在一些实施方案中，感染窗口是空气流减少和O2流增加使得它们在彼此的
±
30％以内、或在彼此的
±
20％以内、或在彼此的
±
10％以内、或在彼此的
±
5％以内的时间区间。
[0022]本专利技术的实施方案包括在生物反应器中生产病毒的方法，其包括以下步骤：在生物反应器中提供宿主细胞；使宿主细胞在生物反应器中生长；观察一组生物反应器过程空气参数；基于生物反应器过程空气参数组计算感染窗口的最佳时间；在感染窗口的最佳时
间期间用至少一种病毒或病毒颗粒感染宿主细胞；温育感染病毒或病毒颗粒的宿主细胞以繁殖病毒；以及任选地，收获病毒。
[0023]在一些实施方案中，宿主细胞是贴壁细胞。在一些实施方案中，生物反应器是平床式(flat
‑
bed)生物反应器，并且使宿主细胞生长的步骤在恒定的初始溶解氧(dO2)水平、pH和温度下进行。在某些实施方案中，生物反应器是一次性平床式生物反应器。
[0024]在某些实施方案中，单独地或与任何前述实施方案组合地，计算感染窗口的最佳时间包括确定进入生物反应器的总空气流的速率降低并与进入生物反应器的O2流的速率的增加趋势交叉或相交的时间。在备选的实施方案中，单独地或与任何前述实施方案组合地，计算感染窗口的最佳时间包括确定生物反应器的空气
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O2差接近零或为零的时间。在其他实施方案中，单独地或与任何前述实施方案组合地，计算感本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在无需计数宿主细胞的步骤的情况下用病毒感染所述宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在生物反应器中培养宿主细胞；观察一组生物反应器过程空气参数；基于所述生物反应器过程空气参数识别第一时间标记；基于所述第一时间标记计算感染窗口的最佳时间；以及在所计算的感染窗口的最佳时间期间感染所述宿主细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是贴壁细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物反应器是固定床生物反应器。4.根据权利要求3所述的方法，其中观察所述生物反应器过程空气参数的步骤包括在多个时间点，测量进入所述生物反应器的空气流的速率以及测量进入所述生物反应器的O2流的速率，以在每个相应的时间点创建相应的当前测量组。5.根据权利要求4所述的方法，其中识别第一时间标记的步骤包括确定进入所述生物反应器的所述空气流的速率降低并与进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势交叉的时间。6.根据权利要求5所述的方法，其中识别第一时间标记的步骤包括计算来自一个或多个当前测量组的一个或多个值，以预测进入所述生物反应器的所述空气流的速率预期降低并与进入所述生物反应器的所述O2流的速率的预期增加趋势交叉的未来时间。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的细胞。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是基因修饰的细胞。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的或基因修饰的哺乳动物细胞、禽细胞或昆虫细胞。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC
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5细胞、BSC
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1细胞、LLC
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MK细胞、CV
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1细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC
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PK细胞、PK 15细胞、WI
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38细胞、T
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FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、PerC6细胞、COR细胞和QOR细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是Vero细胞。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是天然存在的病毒。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是基因修饰的病毒。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒选自天然存在或基因修饰的VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、埃博拉
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扎伊尔病毒、埃博拉
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苏丹病毒、埃博拉
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马尔堡病毒、尼帕病毒或前述中的任何一种的嵌合体。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是病毒载体。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是经修饰的病毒载体，其含有来自另一种感兴趣病毒的糖蛋白。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述病毒载体是重组VSV(rVSV)。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述感染窗口的最佳时间包括达到所述宿主细胞的最佳活细胞密度的时间。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定进入所述生物反应器的所述空气流的速率降低并与进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势交叉的时间。20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定所述生物反应器的空气
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O2差小于预定阈值或预期穿过所述预定阈值以下的时间。21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述感染窗口的最佳时间是进入所述生物反应器的所述空气流的速率的降低趋势和进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势收敛使得它们在彼此的
±
30％以内、或在彼此的
±
20％以内、或在彼此的
±
10％以内、或在彼此的
±
5％以内的时间区间。22.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，所述生物反应器具有在1m2‑
600 m2(作为表面积)的范围内的容量。23.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器具有在600m2‑
2400 m2(作为表面积)的范围内的容量。24.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在所述感染之前不对所述生物反应器中的所述宿主细胞进行计数。25.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其进一步包括在所述感染之后收获所述宿主细胞或所述宿主细胞的产物。26.根据权利要求25所述的方法，其中在所述收获之前不对所述生物反应器中的所述宿主细胞进行计数。27.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器不包括细胞计数设备，并且不与细胞计数设备连接。28.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器不具有用于细胞计数的接入端口。29.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物反应器是封闭的、密封的(例如，气密的)系统。30.一种组合物，其包含由根据权利要求1所述的方法生产的细胞或细胞衍生产物。31.一种在生物反应器中生产病毒的方法，所述方法包括以下步骤：a)在所述生物反应器中提供宿主细胞；b)使所述宿主细胞在所述生物反应器中生长；c)观察一组生物反应器过程空气参数；d)基于所述生物反应器过程空气参数组计算感染窗口的最佳时间；e)在所述感染窗口的最佳时间期间用至少一种病毒或病毒颗粒感染所述宿主细胞；f)温育感染所述病毒或病毒颗粒的所述宿主细胞以繁殖所述病毒；以及任选地，g)收获所述病毒。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞是贴壁细胞。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述生物反应器是平床式生物反应器，并且使所述宿主细胞生长的步骤在恒定的初始dO2水平、pH和温度下进行。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物反应器是一次性平床式生物反应器。35.根据权利要求31至34所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定进
入所述生物反应器的空气流的速率降低并与进入所述生物反应器的O2流的速率的增加趋势交叉的时间。36.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中计算所述感染窗口的最佳时间包括确定所述生物反应器的空气
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O2差小于预定阈值或预期穿过所述预定阈值以下的时间。37.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述感染窗口的最佳时间是进入所述生物反应器的所述空气流的速率的降低趋势和进入所述生物反应器的所述O2流的速率的增加趋势收敛使得它们在彼此的
±
30％以内、或在彼此的
±
20％以内、或在彼此的
±
10％以内、或在彼此的
±
5％以内的时间区间。38.根据权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞感染所述病毒的感染复数(MOI)为约0.1至0.05。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述宿主细胞感染所述病毒的MOI为0.05。40.根据权利要求39所述的方法，其中温育感染所述病毒或病毒颗粒的所述宿主细胞以繁殖所述病毒的步骤包括将所述宿主细胞在不同于恒定的初始dO2水平、pH和温度的恒定的最终dO2水平、pH和温度下温育。41.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的细胞。42.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是基因修饰的细胞。43.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是天然存在的或基因修饰的哺乳动物细胞、禽细胞或昆虫细胞。44.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自Vero细胞、MBCK细胞、MDBK细胞、MRC
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5细胞、BSC
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1细胞、LLC
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MK细胞、CV
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1细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC
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PK细胞、PK 15细胞、WI
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38细胞、T
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FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、PerC6细胞、COR细胞和QOR细胞。45.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是Vero细胞。46.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒是天然存在的病毒。47.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒是基因修饰的病毒。48.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述病毒选自天然存在或基因修饰的VSV、腺病毒、流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、埃博拉
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【专利技术属性】
技术研发人员：佩里，
申请(专利权)人：弹性政府服务公司，
类型：发明
国别省市：