一种提高液相色谱-质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法


[0001]本专利技术涉及及生物医药检测
，具体地，涉及一种提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法。

技术介绍

[0002]维生素K1也称叶绿醌，是肝脏合成凝血酶原不可缺少的物质，它可以促使凝血酶原前体转变为凝血酶原。维生素K缺乏时会引起低凝血酶原血症，出现凝血障碍。维生素K缺乏的临床表现通常为皮肤瘀点、瘀斑、黏膜出血；外伤、手术后渗血不止；也可有血尿、胃肠道出血者。误服灭鼠剂或香豆素类药物过量者，出血症状常较重，部位更为广泛。长期维生素K缺乏亦可引起动脉钙化。维生素K拮抗剂常用于预防血栓栓塞性疾病。在骨组织，双香豆素引起维生素K缺乏可降低骨形成，导致低骨量和骨质疏松。维生素K1血浆浓度可能会受到饮食摄入的影响，也可能会受到甘油三酯的干扰。VK的平均血浆浓度范围为0.22
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8.88nmol/L(0.099
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3.99ng/mL)，但在一般地，研究过程中维生素K1的浓度均低于2nmol/L(0.90ng/mL)。LC
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MS/MS方法是临床上很多常见小分子检测的金标准方法，液相色谱的分离结合质谱的高特异性检测可以使许多常见的小分子化合物得到准确的定量。然而VK1的临床浓度低，浓度范围窄，对于实现准确的定量分析具有较大的挑战，通常需要使用灵敏度较高的质谱仪才能满足检测需求，由于其极性较低，在质谱中常用APCI电离源对其进行检测。相对于ESI电离源，APCI电离源在实验室实际应用中使用频率较低，适用范围窄，所需要的维护频率也更高。
[0003]现有技术中，VK1在血清中的最低含量一般在0.1ng/mL，采用LC
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MS/MS的方法，一般地很难实现定量检测，实际操作中，要么依赖于仪器本身，例如采用HPLC甚至超高效液相色谱，通过更新高灵敏度的仪器的方法来实现定量检测，要么通过优化检测方法来提高定量检测线。例如中国专利技术专利CN114778719A公开了一种基于电喷雾电离源的维生素K1的液相色谱串联质谱检测方法，分别在流动相A和流动相B中分别加入10mM的氟化铵，提高VK1在ESI源下的测试结果在灵敏度和精密度。显然，为了降低检测设备的VK1的定量检测线，采用在流动相中添加电解质氟化铵的方式，通过流动相
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氟化铵的作用来实现VK1与其它干扰成份分离的同时，还能够提高检测VK1的灵敏度的方法在液相色谱串联质谱检测领域中已经得到了广泛应用，同时该方法适用于血清中各微量成分的检测。
[0004]因此，在实际应用中，氟化铵作为电解质均是在液相色谱柱的流动相中，提高维生素的分离效果来提高回收率和质谱检测中的灵敏度。但是，由于氟化铵的添加，会明显增强液相色谱的系统压力，且，氟化铵对色谱柱的损伤是不可逆的，因此大大缩短了色谱柱的使用寿命从而增加了检测成本，即使采用梯度洗脱或降低洗脱速率均无法避免对色谱柱的损伤，因此，从保护色谱柱降低检测成本角度，避免在液相色谱柱中引入氟化铵以保护色谱柱
[0005]因此，在现有技术基础上，如何采用电解质法来保持维生素的回收率和检测灵敏度的同时，降低电解质对色谱柱的损伤来降低检测成本是一个亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，并用异丙醇替代氟化铵来提高质谱检测VK1的灵敏度，提高回收率，同时降低液相色谱仪的系统压力来延长色谱柱使用寿命。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案，一种提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，包括维生素K1的待测样品溶液的制备采用液液萃取法，制备得到初始样品溶液；将所述初始样品溶液采用至少包括异丙醇的水溶液作为复溶剂进行复溶，得到待测样品溶液；结合LC
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MS法，用于提高维生素K1样品的质谱检测灵敏度。
[0008]优选地，所述复溶剂中，异丙醇的体积浓度为10～70％。
[0009]优选地，所述复溶剂还包括甲醇，甲醇的体积浓度为20～60％。
[0010]优选地，所述复溶剂选用异丙醇或异丙醇+甲醇的水溶液，其中，作为最优选地实施方式之一，异丙醇的水溶液中，异丙醇体积含量为70％。
[0011]优选地，该方法还包括将NH4F作为添加剂加入至液相色谱的色谱柱流出的流动相中。
[0012]优选地，所述添加剂通过甲醇溶液添加至所述色谱柱流出的流动相中并与之混合。
[0013]优选地，所述添加剂的添加量为2～20mM。作为优选地实施方式，添加剂的添加量为5～10mM，最优选地，添加量为10mM。
[0014]优选地，含有所述添加剂的甲醇溶液添加至所述流动相中的速率为5～20μL/min。作为优选地实施方式，柱后添加浓度为5至10μL/min，最优地，为5μL/min。
[0015]优选地，柱后添加氟化铵提高质谱检测血清中维生素K1灵敏度的方法具体步骤包括：
[0016](1)待测样品的制备：采用液液萃取法制备得到所述萃取样品液；
[0017](2)待测样品溶液的制备：将步骤(1)得到的所述萃取样品液加入异丙醇中进行复溶得到所述待测样品溶液；
[0018](3)柱前分离：将步骤(2)制备得到的所述待测样品溶液使用液相色谱仪进行色谱分离，并流动相经色谱柱流出；
[0019](4)柱后检测：采用进样泵将含有氟化铵的甲醇溶液连续加入至步骤(2)流出的所述流动相中，使所述添加剂在色谱柱后与所述流动相汇合并共同流入至质谱仪内进行检测。
[0020]优选地，步骤(1)中，包括液液萃取法包括将血清样本放入离心管中，加入内标化合物VK1
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d7的甲醇进行蛋白沉淀，振荡3min后，向其中加入正己烷，振荡并离心后，待测样品进入上层的有机溶剂中，转移上层有机溶剂备用，等待进入下一个步骤。
[0021]优选地，步骤(3)中，以浓度为0.1％甲酸水溶液作为流动相A，含有0.1％甲酸的甲醇溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。
[0022]本专利技术技术方案的技术效果：
[0023]1.通过采用本专利技术的技术方案，在基于LC
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MS技术的基础上，以异丙醇或异丙醇+甲醇作为复溶剂，替代现有技术中的甲醇作为复溶剂，克服了现有技术中仅以流动相作为复溶剂的技术偏见，同时还提高了进入液相色谱中人血清中VK1的溶出量，从而提高VK1的
质谱检测灵敏度，提高回收率，检测方法稳定性良好，能够满足临床检测要求；同时，能够完全替代氟化铵在液相色谱中的作用，提高VK1与干扰物质的分离，提高液相色谱的分离效率，且能够降低液相色谱仪的系统压力，延长了色谱柱的使用寿命。
[0024]2.通过采用本专利技术的技术方案，结合柱后添加氟化铵溶液的方法，即可实现VK1的高精本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，其特征在于，包括维生素K1的待测样品溶液的制备采用液液萃取法，制备得到初始样品溶液；将所述初始样品溶液采用至少包括异丙醇的水溶液作为复溶剂进行复溶，得到待测样品溶液；结合LC
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MS法，用于提高维生素K1样品的质谱检测灵敏度。2.根据权利要1所述的提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，其特征在于，所述复溶剂中，异丙醇的体积浓度为10～70％。3.根据权利要2所述的提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，其特征在于，所述复溶剂还包括甲醇，甲醇的体积浓度为20～60％。4.根据权利要1所述的提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，其特征在于，将NH4F作为添加剂加入至液相色谱的色谱柱流出的流动相中进入质谱中。5.根据权利要求4所述的提高液相色谱
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质谱联用检测血清中维生素K1灵敏度的方法，其特征在于，以甲醇作为溶剂，配置NH4F溶液添加至所述色谱柱流出的流动相中并与之混合。6.根据权利要求5所述的提高液相色谱
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质谱联用法检测血清中维生素K1灵敏度的方法，其特征在于，所述添加剂的添加量为2～20mM。7.根据权利要求4
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6任一项所述的提高液相色谱
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【专利技术属性】
技术研发人员：张林玉，王世立，苏斐，
申请(专利权)人：翊新诊断技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：