蛋白质水解度检测方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质水解度检测方法，本发明专利技术基于三硝基苯磺酸浓度的标准曲线，并且通过蛋白质水解前后消耗的三硝基苯磺酸的量的差，从而依据上述标准曲线以确定水解出的氨基，进而计算蛋白质的水解度。进而计算蛋白质的水解度。进而计算蛋白质的水解度。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质水解度检测方法


[0001]本专利技术属于检测领域，具体涉及生物大分子成分的检测领域，更具体而言，涉及一种动物乳中蛋白水解度的检测方法。

技术介绍

[0002]蛋白是人类成长所必要的营养性物质，在不同的生命阶段，蛋白对人体的发育、健康的促进和维持起到至关重要的作用。
[0003]对于蛋白的获取来源，已经广泛的从动物、植物的来源中获取各种蛋白，例如各种的植物蛋白(豆蛋白等)和从哺乳动物的乳液中的各种乳蛋白。
[0004]作为这些来源的蛋白，在一些需要的情况下，可能需要进一步的加工处理，例如提纯、分离和水解等深加工工艺等。
[0005]例如，作为重要蛋白来源的牛奶是儿童最容易过敏的食物之一，有报道显示，全球约有2
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3％的儿童患有牛奶过敏症。
[0006]为此，人们尝试了对牛奶中蛋白进行适度的降解/酶解来抑制或缓解过敏现象。牛奶蛋白的酶解是改变蛋白质性质、提高蛋白质消化率、降低其致敏性以及生产功能更好的肽的有效途径。但过度水解会产生苦味肽等，导致蛋白质风味改变，影响水解蛋白在食品中的应用。因此，在蛋白质的酶解过程中，控制蛋白质的水解程度是非常重要的。
[0007]牛奶蛋白水解的程度称为水解度(DH)，牛奶蛋白水解后会生成的多肽，这些多肽氨基酸序列及分子量分布(MWD)，再加上水解度，是监测蛋白水解程度的三个重要参数。
[0008]现有技术中，测定DH的方法有很多，原则上主要是测定水解过程中释放的质子(pH
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stat法)或游离氨基(TNBS、OPA或茚三酮法)。
[0009]pH Stat技术是在肽释放的质子滴定中进行的，其中与pH
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Stat相匹配的设备通常是必要的，以保持反应体系中的恒定pH值。但这种方法得到的DH往往需要用其他方法进行校正，如TNBS法或OPA法。
[0010]在游离氨基方法中，考虑到蛋白质水解产物中游离氨基的数量会随着水解的进行而增加，因此水解产物中游离氨基氮的含量也可以表征蛋白质的水解程度。鉴于此，常用方法有三硝基苯磺酸法(TNBS)、甲醛滴定法、茚三酮法、邻苯二甲醛法(OPA)、荧光胺法等。水解过程中释放的游离氨基可以与TNBS、OPA或茚三酮等反应物生成中间产物，可以用光谱方法定量。但也应该指出的是，这些方法总是通过使用特定种类的氨基酸(如亮氨酸或丝氨酸)作为自由氨基的标准来构建工作曲线来量化的。然而，蛋白质水解产物要复杂得多，用单一标准定量的方法不可避免的会导致系统误差。此外，这些方法中，检测物浓度变化的光谱辨别能力较差，即分辨率较差，这导致在一些实验中出现了蛋白水解后测量DH区分度不高的现象。
[0011]例如，引用文献1涉及一种蛋白质水解度测定方法：将蛋白水解液以高效凝胶过滤色谱法测定多肽分子量分布，计算不同分子量范围多肽的质量百分含量，进而计算获得多肽含量、游离氨基酸含量和蛋白水解度；还能够通过准确方法测定系列不同水解程度的蛋
白质标准溶液中游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度，作出标准曲线更准确地定量。
[0012]引用文献2涉及一种蛋白水解度的检测方法及用于检测的试剂盒，首先制备标准曲线和标准对比卡，再检测样品中的蛋白水解度。其技术方案不以测定水解后的氨基酸含量变化为基础，而是将样品中蛋白质析出后间接测定蛋白水解度，因此可抵抗多糖、脂类等多种有机物的干扰。
[0013]引用文献3是利用碱性蛋白酶水解大分子胶原蛋白生成小分子多肽的同时，酶解产物里游离氨基酸含量逐渐增加，其增加的量与水解度大小呈正相关，因此，通过检测酶解液中氨基酸总量或某一种氨基酸含量(如谷氨酸含量)可计算出水解度的大小。
[0014]事实上，上述这些方法虽然已经被使用或研究，但都是间接测量蛋白质水解的方法，其准确性仍然值得怀疑。因此，目前仍然迫切需要更直接、准确、方便的方法来测定蛋白质水解。
[0015]另外，液相色谱
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质谱联用(LC
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MS，液质联用)是近年来发展起来的一种功能强大的分析工具，可以直接检测复杂体系中各组分的分子量，并对这些组分进行定性和定量分析。但目前还没有使用该方法进行蛋白水解的水解度的检测的报告。
[0016]引用文献：
[0017]引用文献1：CN110836936A
[0018]引用文献2：CN102590107A
[0019]引用文献3：CN101246140A

技术实现思路

[0020]专利技术要解决的问题
[0021]如前所述，目前现有技术中检测基于质子释放的滴定法需要额外的辅助校正步骤，对于游离氨基方法中，基于特定氨基酸的标准曲线的对比标准存在系统的偏差。例如，引用文献1中的水解度计算中，依赖于水解得到的氨基酸的平均分子量，引用文献2中主要依赖于吸光光度的分析方法，引用文献3中利用谷氨酸的一种氨基酸的含量来计算水解度。
[0022]因此，上述方法均仍然存在着可靠性的担忧，特别是用于检测的对比基准的物质通常是数据拟合或简化的基准，造成不可避免的系统性偏差。例如，传统上，基于三硝基苯磺酸的光谱方法通常用于DH分析。在此方法中，水解过程中释放的游离氨基与三硝基苯磺酸反应生成可使用光谱方法量化的产物。通过分析与三硝基苯磺酸反应后蛋白质和肽的紫外
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可见(UV
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VIS)吸收光谱的差异来计算DH。而L
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亮氨酸通常用于生成标准曲线。然而，实际样品中的蛋白质水解物比单个氨基酸更复杂，肽的不同序列长度和结构会影响三硝基苯磺酸与游离氨基之间的反应效率，以及过程中的UV
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VIS吸收强度检测，可能导致测量不确定性。
[0023]鉴于此，本专利技术主要是提供一种新的用于蛋白质、尤其是动物来源的蛋白质水解度的检测方法。本专利技术创造性的将游离TNBS检测方法与液质联用技术结合，通过测定水解前后消耗的TNBS的差值以计算水解物中游离氨基的量，进而建立了一种通过检测游离TNBS进行DH分析的新方法。该技术简便、准确、重现性好，为蛋白质水解监测提供了一种新途径。
[0024]用于解决问题的方案
[0025]通过专利技术人长期的研究，发现通过如下技术方案的实施能够解决上述技术问题：
[0026][1].本专利技术提供了一种检测蛋白水解度的方法，所述方法首先包括提供对象蛋白质，以及提供所述对象蛋白质经水解而得到的水解物，其中，
[0027]所述方法还包括：
[0028]三硝基苯磺酸的标准曲线的建立的步骤，使用液相色谱
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质谱检测系统，基于不同浓度的三硝基苯磺酸的质谱峰的面积而建立所述标准曲线；
[0029]所述对象蛋白质消耗的三硝基苯磺酸的检测的步骤，将对象蛋白质与已知量的三硝基苯磺酸反应，之后使用所述液相色谱
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质谱检测系统检测剩余的三硝基苯磺酸的质谱峰面积，并借助所述标准曲线确定对象蛋白质所消耗的三硝基苯磺酸的量A0；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白质水解度的方法，所述方法包括提供对象蛋白质，以及提供所述对象蛋白质经水解而得到的水解物，其特征在于，所述方法还包括：三硝基苯磺酸的标准曲线的建立的步骤，使用液相色谱
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质谱检测系统，基于不同浓度的三硝基苯磺酸的质谱峰的面积而建立所述标准曲线；所述对象蛋白质消耗的三硝基苯磺酸的检测的步骤，将对象蛋白质与已知量的三硝基苯磺酸反应，之后使用所述液相色谱
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质谱检测系统检测剩余的三硝基苯磺酸的质谱峰面积，并借助所述标准曲线确定对象蛋白质所消耗的三硝基苯磺酸的量A0；所述水解物消耗的三硝基苯磺酸的检测的步骤，将水解物与已知量的三硝基苯磺酸反应，之后使用所述液相色谱
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质谱检测系统检测剩余的三硝基苯磺酸的质谱峰面积，并借助所述标准曲线确定所述水解物所消耗的三硝基苯磺酸的量A1，通过所述A0与A1的关系计算所述对象蛋白质的水解度，其中，所述对象蛋白质消耗的三硝基苯磺酸的检测的步骤中的液相色谱
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质谱检测时的检测试样中以干重计的对象蛋白质的质量为B0，所述水解物消耗的三硝基苯磺酸的检测的步骤中的液相色谱
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质谱检测时的检测试样中以干重计的水解物的质量为B1，则在所述水解中产生B1的所需的对象蛋白的质量以干重计为B1
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，进而B0与B1
’
存在可换算关系，所述方法各个步骤中的液相色谱
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质谱检测系统的检测条件实质上相同。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象蛋白质选自源自于动物...

【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏，王象欣，赵玲玉，赵镇文，解庆刚，蒋士龙，张永久，冷友斌，徐飞，陆思宇，耿培忠，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所飞鹤哈尔滨乳品有限公司，
类型：发明
国别省市：