一种基于液相色谱-串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，属于分析化学及药物检测


技术介绍

[0002]多黏菌素E是一种对多药耐药革兰氏阴性菌有抑制作用的阳离子环状多肽类抗生素。多黏菌素E治疗窗窄与肾毒性发生的浓度范围几乎重叠，由于患者个体因素的影响，直接通过临床观察进行药物剂量优化有局限性。为提高临床疗效，降低不良反应，推荐进行治疗药物监测。
[0003]目前报道的测定人血样中多黏菌素E的方法一般为液相色谱分光光度计法，相对液相色谱
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串联色谱技术而言灵敏度低，分析时间长。也有报道采用液相色谱
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串联质谱技术测定人血浆中多黏菌素E1及E2，但前处理方法为固相萃取法，处理过程复杂不易操作且成本较高，无法满足临床对药物浓度监测的的实际需求。
[0004]因此需开发一种特异、快速、高灵敏度且高稳定性的定量分析方法来定量血液中的多黏菌素E，为临床及时提供所需监测的多黏菌素E的血液浓度数据，以对药物的剂量调整。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是：为解决现有测定人血样中多黏菌素E的方法存在灵敏度低，分析时间长，前处理方法过程繁琐耗时等问题，本专利技术提供一种基于液相色谱
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串联色谱技术准确、快速、灵敏度高且成本低廉的定量分析方法测定血样中的多黏菌素E1及E2。
[0006]为达到解决上述问题的目的，本专利技术所采取的技术方案是提供一种基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]获得待测样品，利用液相色谱 串联质谱检测待测样品中多黏菌素E1、E2的含量；
[0008]其中，液相色谱条件如下：
[0009]色谱柱：Luna Omega C18柱；
[0010]流动相A：含0.1％甲酸和1mM醋酸铵的水；
[0011]流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；
[0012]洗针液：50％甲醇；
[0013]采用梯度洗脱，流速为0.55mL/min，柱温为45℃，进样20μL。
[0014]所述梯度洗脱的方式为：0 1.0min，流动相A体积分数保持90％，流动相B体积分数保持10％；1.0 2.0min，流动相A体积分数由90％下降至20％，流动相B体积分数由10％上升至80％；2.0 3.0min，流动相A体积分数保持20％，流动相B体积分数保持80％；3.0 3.1min，流动相A体积分数由20％上升至90％，流动相B体积分数由80％下降至10％；保持流动相A和流动相B的体积分数到4.0min停止。
[0015]优选地，质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度(TEM)：500℃；离子源雾化气(GS1)：50psi；离子源加热辅助气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：8psi；扫描模式：MRM。
[0016]优选地，所述待测样品通过以下步骤获得：量取人血清样品与内标溶液和沉淀剂按照体积比1：1：2的体积混合均与，离心，吸取上清液，加入2倍上清液体积的0.5％甲酸水溶液进行稀释，置于微孔板中，即得待测样品；其中，所述内标溶液为200ng/mL的多黏菌素B1，由含0.1％甲酸的1:1甲醇
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水溶液溶解硫酸多粘菌素B稀释得到，所述沉淀剂为含0.2％甲酸的乙腈。
[0017]优选地，所述人血清样品的采样要求如下：用含有分离胶的采血管采集多黏菌素E服用者(需在持续用药第3天及以上的第一剂给药前和给药后分别采血)的静脉血(3.0mL)，获得标本；并在2h内采用离心沉淀法(4000rpm/min，10min)分离血清，分装，避光保存。
[0018]优选地，所述定量分析采用内标定量法，以多粘菌素E1或多粘菌素E2和内标多粘菌素B1的色谱面积比为纵坐标Y轴，以人血清中多粘菌素E1或多粘菌素E2和内标多粘菌素B1的浓度比为横坐标X轴，分别建立多粘菌素E1、多粘菌素E2的标准曲线，根据各自的标准曲线计算出待测样品中多粘菌素E1和多粘菌素E2的浓度。
[0019]优选地，所述多粘菌素E1的代表性标准曲线为y＝0.00171x+0.00398，线性系数r＝0.99771，检出浓度范围为25
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4000；所述多粘菌素E2的代表性标准曲线为y＝0.00363x+0.00104，线性系数r＝0.99771，检出浓度范围为43
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6879ng/mL。
[0020]优选地，所述标准曲线的建立所采用的标准曲线样品的配制方法如下：
[0021]步骤1：由23.7mg的多黏菌素E用含0.2％甲酸的水溶解并定容到10mL配制成混标储备液WS0，其中多黏菌素E1的浓度为609.33mg/L，多黏菌素E2的浓度为1047.95mg/L；
[0022]步骤2：由混标储备液WS0与稀释液稀释得到7个浓度的20倍浓度工作液WS1
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WS7，具体包括：由80μL WS0和529μL稀释液组成的WS7，由50μL WS0和559μL稀释液组成的WS6，由30μL WS0和579μL稀释液组成的WS5，由20μL WS0和589μL稀释液组成的WS4，由10μL WS0和599μL稀释液组成的WS3，由20μL WS6和480μL稀释液组成的WS2，由10μL WS6和990μL稀释液组成的WS1，所述稀释液为含0.1％甲酸的1:1甲醇
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水溶液；
[0023]步骤3：分别取10μL上述步骤2所得的的20倍浓度工作液WS1
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WS7，各自加入190μL空白基质，配制得到标准曲线样品W1
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W7，所述空白基质为空白人血清；
[0024]所述标准曲线样品W1
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W7中多黏菌素E1的浓度分别为：25.00、100.00、500.00、1000.00、1500.00、2500.00、4000.00ng/mL，多黏菌素E2的浓度分别为：43.00、171.99、859.93、1719.85、2579.78、4299.63、6879.41ng/mL。
[0025]优选地，标准曲线通过质控品验证，所述质控品20倍浓度工作液由上述混标储备液WS0用稀释液(含0.1％甲酸的1:1甲醇
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水溶液)稀释得到Hs、Ms、Ls和LLs；其中Hs由60μL WS0和549μL稀释液组成；Ms由25μL WS0和584μL稀释液组成；Ls由5μL WS0和604μL稀释液组成；LLs由10μL Ms和490μL稀释液组成。
[0026]所述质控品由质控品20倍浓度工作液与空白基质(空白人血清)配制而成；分别取10μL充分混匀的Hs、Ms、Ls和LLs，各本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，其特征在于，包括以下步骤：获得待测样品，利用液相色谱串联质谱检测待测样品中多黏菌素E1、E2的含量；其中，液相色谱条件如下：色谱柱：Luna Omega C18柱；流动相A：含0.1％甲酸和1mM醋酸铵的水；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；洗针液：50％甲醇；采用梯度洗脱，流速为0.55mL/min，柱温为45℃，进样20μL。所述梯度洗脱的方式为：0 1.0min，流动相A体积分数保持90％，流动相B体积分数保持10％；1.02.0min，流动相A体积分数由90％下降至20％，流动相B体积分数由10％上升至80％；2.0 3.0min，流动相A体积分数保持20％，流动相B体积分数保持80％；3.0 3.1min，流动相A体积分数由20％上升至90％，流动相B体积分数由80％下降至10％；保持流动相A和流动相B的体积分数到4.0min停止。2.如权利要求1所述的基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，其特征在于，质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度(TEM)：500℃；离子源雾化气(GS1)：50psi；离子源加热辅助气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：8psi；扫描模式：MRM。3.如权利要求1所述的基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，其特征在于，所述待测样品通过以下步骤获得：量取人血清样品与内标溶液和沉淀剂按照体积比1：1：2的体积混合均与，离心，吸取上清液，加入2倍上清液体积的0.5％甲酸水溶液进行稀释，置于微孔板中，即得待测样品；其中，所述内标溶液为200ng/mL的多黏菌素B1，由含0.1％甲酸的1:1甲醇
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水溶液溶解硫酸多粘菌素B稀释得到，所述沉淀剂为含0.2％甲酸的乙腈。4.如权利要求3所述的基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，其特征在于，所述人血清样品的采样要求如下：用含有分离胶的采血管采集多黏菌素E服用者的静脉血，获得标本；并在2h内采用离心沉淀法分离血清，分装，避光保存。5.如权利要求1所述的基于液相色谱
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串联质谱定量分析血样中多黏菌素E1、E2的方法，其特征在于，所述定量分析采用内标定量法，以多粘菌素E1或多粘菌素E2和内...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆秋涯，贺晓双，赵珺涛，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：