用于血友病A的基因治疗的具有增加的表达的编码重组FVIII变体的病毒载体制造技术

除其他方面外，本公开提供用于在哺乳动物细胞中表达的编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开还提供用于治疗血友病A的哺乳动物基因疗法载体和方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
用于血友病A的基因治疗的具有增加的表达的编码重组FVIII变体的病毒载体
[0001]本申请是申请日为2016年11月11日、申请号为201680067846.4(国际申请号为PCT/US2016/061684)、名称为“用于血友病A的基因治疗的具有增加的表达的编码重组FVIII变体的病毒载体”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2015年11月13日提交的美国临时专利申请号62/255,317的优先权，该临时专利申请的内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
[0004]序列表
[0005]本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且以全文引用的方式并入本文中的序列表。所述ASCII副本创建于2016年11月9日，命名为008073_5107_WO_Sequence_Listing.txt并且大小为353,479字节。
[0006]专利技术背景
[0007]血液凝固通过称为凝血级联的相互依赖的生物化学反应的复杂且动态的生物途径进行。凝血因子VIII(FVIII)是级联中的关键组分。因子VIII被招募到出血位点，并且与活化的因子IX(FIXa)和因子X(FX)形成X酶复合物。X酶复合物活化FX，FX又将凝血酶原活化为凝血酶，然后凝血酶活化凝血级联中的其他组分以产生稳定的凝块(在Saenko等,Trends Cardiovasc.Med.,9:185
‑
192(1999)；Lenting等,Blood,92:3983
‑/>3996(1998)).
[0008]血友病A是一种以缺乏因子VIII活性为特征的先天性X连锁性出血性病症。降低的因子VIII活性抑制了凝血级联中的正反馈回路。这会导致不完全凝固，表现为持续时间延长、大面积青紫、自发性口腔和鼻腔出血、关节僵硬和慢性疼痛以及严重情况下可能出现内出血和贫血的出血事件(Zhang等,Clinic.Rev.Allerg.Immunol.,37:114
‑
124(2009))。
[0009]常规地，通过因子VIII替代疗法来治疗血友病A，所述因子VIII替代疗法由向血友病A个体施用因子VIII蛋白(例如血浆衍生或重组产生的因子VIII)组成。预防性地施用因子VIII以预防出血事件或响应于急性出血事件降低其频率，和/或围手术期施用以管理手术期间的出血。然而，因子VIII替代疗法有几个不希望的特征。
[0010]第一，因子VIII替代疗法是用于治疗或管理血友病A，但不能治愈潜在的因子VIII缺乏。由于这个原因，血友病A个体在其一生中都需要因子VIII替代疗法。持续治疗是昂贵的，并且要求个体保持严格的依从性，因为仅缺少少数预防性剂量就会对严重血友病A的个体产生严重后果。
[0011]第二，因为因子VIII在体内的半衰期相对较短，常规预防性因子VIII替代疗法需要每两天或每三天进行施药。这给个体在其生活中保持依从性带来负担。尽管第三代“长效”因子VIII药物可能会降低施用频率，但使用这些药物的预防性因子FVIII替代疗法仍需要永久性地每月、每周或更频繁的进行施药。举例来说，用ELOCTATE
TM
[抗血友病因子(重组)，Fc融合蛋白]预防性治疗需要每3到5天施药(ELOCTATE
TM
Prescribing Information,Biogen Idec Inc.,(2015))。此外，尚未完全了解化学修饰的生物制剂(例如聚乙二醇化多肽)的长期影响。
[0012]第三，接受因子VIII替代疗法的所有个体中有15％至30％形成抗因子VIII抑制剂抗体，从而导致疗法效率低。可使用因子VIII旁路疗法(例如施用血浆衍生或重组产生的凝血酶原复合物浓缩物)来治疗形成抑制剂抗体的个体的血友病。然而，因子VIII旁路疗法与因子VIII替代疗法相比不太有效(Mannucci P.M.,J Thromb Haemost.,1(7):1349
‑
55(2003))并且可能与心血管并发症的风险增加有关(Luu和Ewenstein,Haemophilia,10增刊2:10
‑
16(2004))。
[0013]体细胞基因疗法为血友病A的治疗带来极大的希望，因为它可以补救潜在的低表达功能性因子VIII活性(例如归因于错义或无义突变)，而不是提供一次剂量的因子VIII活性给个体。由于作用机制的这种差异，与因子VIII替代疗法相比，一次施用因子VIII基因疗法载体可为个体提供几年的因子VIII，从而降低治疗成本并且消除了对持续患者依从性的需要。
[0014]凝血因子IX(FIX)基因疗法已被有效地用于治疗血友病B个体，血友病B是一种以因子IX活性降低为特征的相关凝血病状(Manno C.S.等,Nat Med.,12(3):342
‑
47(2006))。然而，因子VIII基因疗法存在几个独特的挑战。举例来说，全长野生型因子VIII多肽(2351个氨基酸；UniProt登录号P00451)比全长野生型因子IX多肽(461个氨基酸；UniProt登录号P00740)大五倍。因此，野生型因子VIII的编码序列为7053个碱基对，这太大而不能包装在常规AAV基因疗法载体中。此外，报道的因子VIII的B
‑
结构域缺失变体(BDD
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FVIII)的重组表达是差的。因此，若干小组已试图改变BDD
‑
FVIII构建体的密码子使用，但取得的成功有限。
专利技术概要
[0015]因此，对编码序列更高效地包装到基因疗法载体中并且经由基因疗法载体递送的因子VIII变体存在需要。还对更高效地表达因子VIII的合成的密码子改变的核酸存在需要。此类因子VIII变体和密码子改变的核酸允许因子VIII缺乏(例如血友病A)的改善的治疗。公开的密码子改变的因子VIII变体减少或消除了上述缺乏和与治疗因子VIII缺乏(例如血友病A)相关的其他问题。
[0016]根据一些实施方案，本公开提供编码因子VIII变体的核酸，所述核酸与公开的密码子改变的因子VIII重链(例如CS01
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HC
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NA、CS04
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HC
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NA或CS23
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HC
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NA)和轻链(CS01
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LC
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NA、CS04
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LC
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NA或CS23
‑
LC
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NA)的序列具有高序列同一性。在一些实施方案中，这些核酸在编码因子VIII重链和轻链的序列之间进一步包括编码接头序列的序列，所述接头序列替代天然因子VIII B
‑
结构域(例如包含弗林蛋白酶裂解位点(furin cleavage site)的接头序列)。
[0017]在一个方面中，本公开提供一种包括编码因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含与CS01
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:13)具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码因子VIII多肽。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与CS01
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:13)具有至少99％的同一性。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为CS01
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:13)。4.一种包含编码因子VIII多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述因子VIII多肽包含轻链、重链以及将所述重链的C端连接至所述轻链的N端的多肽接头，其中所述因子VIII多肽的所述重链是由与CS01
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:24)具有至少95％同一性的第一核苷酸序列编码；其中所述因子FVIII多肽的所述轻链是由与CS01
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:25)具有至少95％同一性的第二核苷酸序列编码；并且其中所述多肽接头包含弗林蛋白酶裂解位点。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多肽接头是由与BDLO01(SEQ ID NO:5)具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码。6.如权利要求4或5所述的多核苷酸，其中：所述第一核苷酸序列与CS01
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:24)具有至少99％同一性；并且所述第二核苷酸序列与CS01
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:25)具有至少99％的同一性。7.如权利要求4或5所述的多核苷酸，其中：所述第一核苷酸序列为CS01
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:24)；并且所述第二核苷酸序列CS01
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:25)。8.一种包含与CS04
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:1)具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码因子VIII多肽。9.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与CS04
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:1)具有至少99％的同一性。10.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为CS04
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:1)。11.一种包含编码因子VIII多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述因子VIII多肽包含轻链、重链以及将所述重链的C端连接至所述轻链的N端的多肽接头，其中所述因子VIII多肽的所述重链是由与CS04
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:3)具有至少95％同一性的第一核苷酸序列编码；其中所述因子FVIII多肽的所述轻链是由与CS04
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:4)具有至少95％同一性的第二核苷酸序列编码；并且其中所述多肽接头包含弗林蛋白酶裂解位点。12.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述多肽接头是由与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码。13.如权利要求11或12所述的多核苷酸，其中：所述第一核苷酸序列与CS04
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:3)具有至少99％的同一性；并且所述第二核苷酸序列与CS04
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:4)具有至少99％的同一性。14.如权利要求11或12所述的多核苷酸，其中：所述第一核苷酸序列为CS04
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:3)；并且
所述第二核苷酸序列CS04
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:4)。15.一种包含与CS23
‑
FL
‑
NA具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码因子VIII多肽。16.如权利要求15所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与CS23
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:20)具有至少99％的同一性。17.如权利要求15所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为CS23
‑
FL
‑
NA(SEQ ID NO:20)。18.一种包含编码因子VIII多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述因子VIII多肽包含轻链、重链以及将所述重链的C端连接至所述轻链的N端的多肽接头，其中所述因子VIII多肽的所述重链是由与CS23
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:22)具有至少95％同一性的第一核苷酸序列编码；其中所述因子FVIII多肽的所述轻链是由与CS23
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:23)具有至少95％同一性的第二核苷酸序列编码；并且其中所述多肽接头包含弗林蛋白酶裂解位点。19.如权利要求18所述的多核苷酸，其中所述多肽接头是由与BDLO23(SEQ ID NO:7)具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码。20.如权利要求18或19所述的多核苷酸，其中：所述第一核苷酸序列与CS23
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:22)具有至少99％的同一性；并且所述第二核苷酸序列与CS23
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:23)具有至少99％的同一性。21.如权利要求18或19所述的多核苷酸，其中：所述第一核苷酸序列为CS23
‑
HC
‑
NA(SEQ ID NO:22)；并且所述第二核苷酸序列CS23
‑
LC
‑
NA(SEQ ID NO:23)。22.如权利要求4、11以及18中任一项所述的多核苷酸，其中编码的多肽接头包含氨基酸序列与选自由以下各项组成的组的糖基化肽具有至少92％同一性的糖基化肽：NG1
‑
AA、NG4
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AA、NG5
‑
AA、NG6
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AA、NG7
‑
AA、NG9
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AA、NG10
‑
AA、NG16
‑
AA、NG17
‑
AA、NG18
‑
AA、NG19
‑
AA、NG20
‑
AA、NG21
‑
AA以及NGV
‑
AA。23.如权利要求4、11以及18中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码的多肽接头包含选自由以下各项组成的组的糖基化肽：NG1
‑
AA、NG4
‑
AA、NG5
‑
AA、NG6
‑
AA、NG7
‑
AA、NG9
‑
AA、NG10
‑
AA、NG16
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AA、NG17
‑
AA、NG18
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AA、NG19
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AA、NG20
‑
AA、NG21
‑
AA以及NGV
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AA。24.如权利要求22或23所述的多核苷酸，其中所述糖基化肽是由核苷酸序列与选自由以下各项组成的组的序列具有至少95％同一性的多核苷酸编码：NG1
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NA、NG4
‑
NA、NG5
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NA、NG6
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NA、NG7
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NA、NG9
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NA、NG10
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NA、NG16
‑
NA、NG17
‑
NA、NG18
‑
NA、NG19
‑
NA、NG20
‑
NA、NG21
‑
NA以及NGV
‑
NA。25.如权利要求22或23所述的多核苷酸，其中所述糖基化肽是由核苷酸序列选自以下各项中的一种的多核苷酸编码：NG1
‑
NA、NG4
‑
NA、NG5
‑
NA、NG6
‑
NA、NG7
‑
NA、NG9
‑
NA、NG10
‑
NA、NG16
‑
NA、NG17
‑
NA、NG18
‑
NA、NG19
‑
NA、NG20
‑
NA、NG21
‑
NA以及NGV
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NA。26.如权利要求4、11以及18中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽接头是由与选自由以下各项组成的组的序列具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码：BDLNG1
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NA、BDLNG3
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NA、BDLNG5
‑
NA、BDLNG6
‑
NA、BDLNG9
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NA、BDLNG10
‑
NA、BDLNG16
‑
NA、BDLNG17
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NA、
BDLNG18
‑
NA、BDLNG19
‑
NA、BDLNG20
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NA以及BDLNG21
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NA。27.如权利要求1至21中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与CS04
‑
FL
‑
AA(SEQ ID NO:2)具有至少95％同一性的氨基酸序列的因子VIII多肽。28.如权利要求1至21中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含CS04
‑
FL
‑
AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的因子VIII多肽。29.一种包含与CS01
‑
SC1
‑
NA(SEQ ID NO:26)具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码单链因子VIII多肽。30.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与CS01
‑
SC1
‑
NA(SEQ ID NO:26)具有至少99％的同一性。31.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为CS01
‑
SC1
‑
NA(SEQ ID NO:26)。32.一种包含与CS04
‑
SC1
‑
NA(SEQ ID NO:9)具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码单链因子VIII多肽。33.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与CS04
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SC1
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NA(SEQ ID NO:9)具有至少99％的同一性。34.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为CS04
‑
SC1
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NA(SEQ ID NO:9)。35.一种包含与CS23
‑
SC1
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NA(SEQ ID NO:28)具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码单链因子VIII多肽。36.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与CS23
‑
SC...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：