L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体涉及L

【技术实现步骤摘要】
L
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谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体涉及L
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谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用。

技术介绍

[0002]L
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谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，化学名称为2
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氨基
‑4‑
氨甲酰基丁酸。L
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谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，还可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中具有重要作用。
[0003]目前，L
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谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。目前主要以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为生产菌发酵生产L
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谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。但目前生产L
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谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，L
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谷氨酰胺的产量和转化率仍不理想，工业上对L
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谷氨酰胺的需求量较高，现有的菌种无法满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的是提供大肠杆菌RarD蛋白的应用以及表达大肠杆菌RarD蛋白的棒状杆菌属微生物。
[0005]本专利技术的第二目的是提供一种RarD蛋白突变体及其应用。
[0006]本专利技术的第三目的是提供表达RarD蛋白突变体的重组微生物以及利用该微生物发酵生产L
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谷氨酰胺或其衍生物的方法。
[0007]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供大肠杆菌RarD蛋白或其编码基因在提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L
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谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L
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谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
[0009]RarD为大肠杆菌的假定转运蛋白，本专利技术发现，大肠杆菌RarD蛋白具有将微生物细胞内的L
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谷氨酰胺向细胞外转运的活性，可用于提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力，进而提高L
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谷氨酰胺的产量、转化率。
[0010]对于大肠杆菌RarD蛋白或其编码基因的序列，本领域技术人员可通过公开的数据库等获得，例如：其中一种大肠杆菌RarD蛋白的基因编号为b3819，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0011]具体地，上述应用为通过增强RarD蛋白的活性和/或增强RarD蛋白的表达提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力或提高微生物的L
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谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率。
[0012]以上所述的增强RarD蛋白的活性、增强RarD蛋白的表达可通过以下1)
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6)任一方式或其任选的组合实现：
[0013]1)通过导入具有RarD蛋白编码基因的质粒而增强；
[0014]2)通过增加染色体上RarD蛋白编码基因的拷贝数而增强；
[0015]3)通过改变染色体上RarD蛋白编码基因的启动子序列而增强；
[0016]4)通过将强启动子与RarD蛋白编码基因可操作地连接而增强；
[0017]5)通过对RarD蛋白的氨基酸序列进行改变而增强；
[0018]6)通过对RarD蛋白编码基因的序列进行改变而增强。
[0019]以上所述的微生物优选为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
[0020]本专利技术中，所述L
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谷氨酰胺的衍生物为以L
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谷氨酰胺为前体进行生物合成的物质，包括但不限于核苷类物质、精氨酸等。
[0021]第二方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物表达大肠杆菌RarD蛋白。
[0022]以上所述的表达大肠杆菌RarD蛋白可通过以下1)
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2)任一方式或其任选的组合实现：
[0023]1)导入具有RarD蛋白编码基因的质粒；
[0024]2)在染色体上插入RarD蛋白编码基因。
[0025]优选地，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
[0026]第三方面，本专利技术提供一种RarD蛋白突变体，以野生型大肠杆菌的RarD蛋白为参考序列，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为除脯氨酸和丝氨酸以外的其它氨基酸的突变。
[0027]优选地，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为苏氨酸或亮氨酸的突变。
[0028]本专利技术发现，将RarD蛋白的第188位氨基酸突变为苏氨酸或亮氨酸能够显著提高其L
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谷氨酰胺转运活性，可用于提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力，进而提高L
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谷氨酰胺的产量、转化率。
[0029]进一步优选地，所述RarD蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。
[0030]其中，SEQ ID NO.1所示的RarD蛋白突变体的第188位氨基酸突变为苏氨酸，SEQ ID NO.2所示的RarD蛋白突变体的第188位氨基酸突变为亮氨酸。
[0031]第四方面，本专利技术提供编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子。
[0032]根据上述RarD蛋白突变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够确定编码所述RarD蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列。
[0033]第五方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
[0034]其中，所述表达盒为将所述核酸分子与转录或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
[0035]所述载体包括但不限于质粒载体。
[0036]所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞，优选为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
[0037]第六方面，本专利技术提供所述RarD蛋白突变体或所述核酸分子在提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L
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谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L
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谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
[0038]优选地，所述微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
[0039]第七方面，本专利技术提供一种重组微生物，所述重组微生物表达所述RarD蛋白突变体。
[0040]优选地，所述重组微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。
[0041]以上所述的表达RarD蛋白突变体可通过以下1)
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2)任一方式或其任选的组合实现：
[0042]1)导入具有RarD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌RarD蛋白或其编码基因在提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力、提高微生物的L
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谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率或构建用于生产L
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谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过增强RarD蛋白的活性和/或增强RarD蛋白的表达提高微生物的L
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谷氨酰胺外运能力或提高L
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谷氨酰胺或其衍生物的产量或转化率；优选地，所述微生物为棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或芽孢杆菌属微生物。3.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物表达大肠杆菌RarD蛋白。4.RarD蛋白突变体，其特征在于，以野生型大肠杆菌的RarD蛋白为参考序列，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为除脯氨酸和丝氨酸以外的其它氨基酸的突变；优选地，所述RarD蛋白突变体具有第188位氨基酸突变为苏氨酸或亮氨酸的突变；更优选地，所述RarD蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。5.编码权利要求4所述的RarD蛋白突变体的核酸分子。6.含有权利要求5所述的核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚嘉琪，吴涛，栾明月，薛婷莉，胡丹，张庆帅，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：