一种利用液相色谱-串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法


[0001]本专利技术涉及领域仪器分析领域，具体地，涉及一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法。

技术介绍

[0002]黏多糖贮积症是由于人体细胞溶酶体内降解酸性黏多糖的水解酶缺乏，系为罕见病，不能完全降解代谢的黏多糖在溶酶体中贮积，导致一系列临床表现，包括骨骼畸形，严重气道阻塞，心肌病，以及生长发育障碍等。该病是溶酶体贮积症病种的非常重要的一类，可分为I，II，III，IV，VI，VII，IX型等7种，涉及11个基因编码的11种溶酶体酶。黏多糖主要包括硫酸软骨素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸角质素以及透明质酸。可通过检测细胞内堆积的不同类别的黏多糖成分，提供黏多糖贮积症确诊和分型依据。
[0003]目前用于黏多糖分析的方法有甲苯氨蓝染色法、甲基甲烯蓝尿液黏多糖定量，以及尿液黏多糖电泳法。甲苯氨蓝染色法为定性方法，无法提供尿液黏多糖的种类，对黏多糖贮积症分型没有帮助，且易受到尿液其他蛋白质的干扰而呈现假阳性结果。
[0004]甲基甲烯蓝尿液黏多糖定量以尿液肌酐为基础单位，年龄因素会影响数值的高低，且易受尿液其他蛋白质干扰，也无法提供尿液黏多糖的种类。只能作为黏多糖贮积症诊断的参考。
[0005]尿液黏多糖电泳能分离黏多糖成分：硫酸软骨素，硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素，提供黏多糖贮积症分型的依据。但由于电泳法是条带定性分析，其结果判读带有主观性，若黏多糖分子分离不佳，容易造成判读错误，且无法精确定量分析。目前越来越多的方法可用于治疗黏多糖贮积症，但判定这些方法疗效的重要检测是尿液黏多糖含量的变化，因此甲苯氨蓝染色法、甲基甲烯蓝尿液黏多糖定量，以及尿液黏多糖电泳法均不能用于黏多糖贮积症治疗患者的疗效随访。
[0006]据文献报道，国外有实验室利用质谱法测定尿液中黏多糖的浓度。方法1：首先采用阿尔新蓝沉淀尿液中的黏多糖后，氯化钠甲醇溶液溶解黏多糖
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阿尔新蓝复合物，加入碳酸钠解离复合物后，乙醇再次沉淀黏多糖，氮气吹干，用含二甲基亚甲基蓝的水溶液溶解沉淀物。醇解反应：取2微升上述溶解物，氮气吹干；加入300微升盐酸甲醇，65℃，反应75分钟，氮气吹干；加入100微升内标和100微升乙腈复溶，氮气吹干；最后采用100微升乙酸铵溶液复溶样本上样分析。
[0007]方法2：以尿液样本为待测样本，氮气吹干后加入大量的盐酸甲醇反应约1小时后氮气吹干，上样分析。
[0008]关于上述方法1利用阿尔新蓝沉淀黏多糖，前处理复杂，需要反复吹干。方法2虽然相对简便，但是基于过程中的试剂添加要求，当其进行反复吹干的情况下，存在耗时长(每次吹干过程均需要45分钟以上)，试剂用量大成本提高且不环保的问题。
[0009]方法1和方法2的检测样本均为液体尿液样本，异地或远程医疗的患者，在诊疗过
程中存在邮寄及运输样本不便的问题。
[0010]另外，上述的半定量方法存在不能精确定量，无法根据含量差异来评价黏多糖贮积症患者的治疗效果和治疗方案调整。且传统的半定量方法容易受其他物质干扰，质谱法特异性好，检测限低，例如：MPSI型和MPSII型的患者尿液黏多糖电泳经常出现无HS条带或者不稳定的情况，这样导致了分型的不准确。无法精确定量严重影响了后续治疗方案的判断和优化。

技术实现思路

[0011]本专利技术旨在克服上述缺陷，提供了一种用时短，操作便捷的分析方法，且该方法能够稳定定量检出硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素的含量。
[0012]本专利技术提供了一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于,包含如下检测步骤：
[0013]S1.吹干样本：
[0014]获取样本的上清液，向其中添加醇后氮气吹干(约计10
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15min)，得到吹干的样品I；
[0015]S2.衍生反应：
[0016]向S1的吹干的样品I中添加2，2
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二甲氧基丙烷和盐酸甲醇，经振荡涡旋发生衍生反应，待衍生反应结束后，氮气吹干(约计8
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12min)，得到吹干的样品II；
[0017]关于该2，2
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二甲氧基丙烷的加入能有效去除残余水份或水蒸气，而且其还可作为保护剂防止副反应的发生，基于该制剂的加入能够有效提高衍生效率。
[0018]S3.制备内标复溶样品：
[0019]向吹干的样品II中加入混合同位素内标的水溶液复溶，振荡即得待测样品；
[0020]S4.检测样本：
[0021]采用液相色谱串联质谱法检测上述待测样品。
[0022]此外，本专利技术提供的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：
[0023]上述样本的上清液获取的方法如下所示：
[0024]当样本为含有尿液的载体时，向该载体缓慢淋滴超纯水后，经离心获取上清液；
[0025]当液体为尿液液体样本时，经离心获取上清液。
[0026]进一步地，本专利技术提供的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：
[0027]S1中，上述醇的添加量为上清液的0.8
‑
1.2倍(体积)。
[0028]进一步地，本专利技术提供的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：
[0029]S2中2，2
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二甲氧基丙烷与盐酸甲醇的添加量为上清液的10
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15倍(体积)；
[0030]上述2，2
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二甲氧基丙烷与盐酸甲醇的体积比为1：15
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30。
[0031]进一步地，本专利技术提供的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：
[0032]S2中衍生反应温度为60
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70℃，时间为65
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85分钟。
[0033]进一步地，本专利技术提供的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：
[0034]S3中，上述制备内标的方法如下所示：
[0035]S3
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1.将乙酰氯滴加到氘代甲醇中，制备氘代盐酸甲醇；
[0036]S3
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2.分别取硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素的标准品于小瓶中，氮气吹干，各小瓶中分别加入氘代盐酸甲醇，涡旋混匀；
[0037]S3
‑
3.将上述混匀好的样品放入加热箱，在60
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70℃条件下反应65
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85分钟，反应完成后氮气吹干，加入水复溶，涡旋混匀，得到氘代内标：D6
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硫酸乙酰肝素、D6
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硫酸皮肤素和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于,包含如下检测步骤：S1.吹干样本：获取样本的上清液，向其中添加醇后氮气吹干，得到吹干的样品I；S2.衍生反应：向S1的吹干的样品I中添加2，2
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二甲氧基丙烷和盐酸甲醇，经振荡涡旋发生衍生反应，待衍生反应结束后，氮气吹干，得到吹干的样品II；S3.制备内标复溶样品：向吹干的样品II中加入混合同位素内标的水溶液复溶，振荡即得待测样品；S4.检测样本：采用液相色谱串联质谱法检测所述待测样品。2.如权利要求1所述的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：所述样本的上清液获取的方法如下所示：当样本为含有尿液的载体时，向该载体缓慢淋滴超纯水后，经离心获取上清液；当液体为尿液液体样本时，经离心获取上清液。3.如权利要求1所述的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：S1中，所述醇的添加量为上清液的0.8
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1.2倍(体积)。4.如权利要求1所述的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：S2中2，2
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二甲氧基丙烷与盐酸甲醇的添加量为上清液的10
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15倍(体积)；所述2，2
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二甲氧基丙烷与盐酸甲醇的体积比为10：15
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30。5.如权利要求1所述的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：S2中衍生反应温度为60
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70℃，时间为65
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85分钟。6.如权利要求1所述的一种利用液相色谱
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串联质谱仪检测尿样中黏多糖含量的方法，其特征在于：S3中，所述制备内标的方法如下所示：S3
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1.将乙酰氯滴加到氘代甲醇中，制备氘代盐酸甲醇；S3
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2.分别取硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素的标准品于小瓶中，氮气吹干，各小瓶中分别加入氘代盐酸甲醇，涡旋混匀；S3
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3.将上述混匀好的样品放入加热箱，在60
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70℃条件下反应65
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85分钟，反应完成后氮气吹干，加入水复溶，涡旋混匀，得到氘代内标：D6
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硫酸乙酰肝素、D6
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硫酸皮肤素和D6
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硫酸软骨素的储备液，
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20℃以下保存待用；S3
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4.每次使用前取出氘代内标储备液，纯水稀释配制混合内标工...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠文，占霞，高晓岚，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：