一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法技术

本发明专利技术属于角鲨烯提取技术领域，尤其涉及一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，经酿酒酵母发酵液准备、离心后菌体洗涤、高压均质破碎、两相萃取旋蒸、柱层析旋蒸和除菌过滤步骤即得，或将其中的两相萃取旋蒸和柱层析旋蒸步骤替换为烘干菌体、超临界萃取以及分子蒸馏步骤。本发明专利技术中提纯工艺简单、回收率高和产品纯度较高，纯度上可在97%以上，且也可以达到100%的纯度；并可避免了有机试剂的使用，大大节约了成本，绿色生态环保，极易实现产业化和推广。极易实现产业化和推广。极易实现产业化和推广。

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法


[0001]本专利技术属于角鲨烯提取
，尤其涉及一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法。

技术介绍

[0002]角鲨烯是一种三萜,是植物、动物和人类合成甾醇的中间体，广泛存在于植物、动物和人体中。最开始是从深海鲨鱼的肝油中真空分馏得到一种不饱和烃，化学式为C
30
H50,结构式如下：。
[0003]角鲨烯是由角鲨烯合成酶合成，将两个单位的法尼基焦磷酸(萜类和类固醇的直接前体)转化为角鲨烯。
[0004]作为副类固醇，维生素D的生物合成也受角鲨烯的调节。此外，作为每个类固醇家族的前体，角鲨烯是人体的重要组成部分。在人类中，新生儿血液中的角鲨烯浓度最高，但其含量在30至40岁之间突然开始下降。
[0005]在人体中，角鲨烯由肝脏合成，并由皮脂腺大量分泌,占皮脂腺分泌脂质的12%，通过小密度脂蛋白和极小密度脂蛋白在血液中被运输。人体中角鲨烯的最高浓度出现在皮肤脂质中约500μg/g，在脂肪组织中约300μg/g；而在发生活性生物合成的器官中，浓度要低得多，如在肝脏中为75μg/g或在小肠中为42μg/g。
[0006]角鲨烯具有着广泛的用途：角鲨烯在护肤品中的应用，为角鲨烯对自由基的稳定性使人体皮肤表面能够抵抗脂质过氧化,可作为保湿霜中的抗氧化剂、抗静电剂和润肤剂等。角鲨烯在保健品中的应用，为角鲨烯对长期用脑过度、精力不足的脑力劳动者，经常感觉疲劳、嗜睡、头晕、记忆力下降、注意力不集中者，以及脂肪肝患者和经常喝酒、肝脏负担重的人群有缓解和保护作用。角鲨烯作为中间体的应用，为角鲨烯是多种烷类和甾醇类物质合成的中间体。角鲨烯在疾病预防和治疗中的应用，为角鲨烯在疾病治疗和预防上有着非常广泛的作用。角鲨烯与吐温
‑
80、司班85、生育酚等按比例分别配制成的MF59佐剂与AS03佐剂已应用于多款已批准上市疫苗，并在全球范围内进行了大规模接种充分证明了角鲨烯配制的新型佐剂的安全性及有效性，在人类的疾病预防上做出了重大贡献。
[0007]角鲨烯对于乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和与Ras癌基因突变相关的类似肿瘤能起到一定的预防作用。角鲨烯可能通过以下机制起到抗癌作用:（1）通过内源性胆固醇合成的负反馈调节间接抑制HMG
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CoA还原酶，抑制Ras癌蛋白法尼化，限制HMG
‑ꢀ
CoA (3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A)转化为DNA合成和细胞增殖所必需的甲羟戊酸;（2）调节外源代谢酶的生物合成和功能，从而改变致癌物的代谢激活;
（3）作为自由基清除剂。
[0008]角鲨烯被认为是鲨鱼没有癌症的重要因素，因为鲨鱼鱼肝油中含有超过40%的角鲨烯，角鲨烯同样被认为是地中海地区人类癌症发病率低的重要因素，因为地中海地区的人们的饮食中含有大量的橄榄，橄榄中富含角鲨烯。
[0009]由于角鲨烯的广泛作用导致需求量较大，目前角鲨烯的来源有鲨鱼肝脏、植物油、化学合成、生物合成等，并且绝大部分来源于鲨鱼肝脏。所用角鲨烯提取纯化方法主要有：超临界萃取、分子蒸馏法、离子交换色谱法、反相色谱法、精馏法、冷冻结晶、高效逆流色谱法、两相萃取、皂化、甲酯化、减压蒸馏等多种方法组合。
[0010]中国专利CN102146014A的说明书中公开了一种以油茶籽为原料提取角鲨烯的工艺，其流程为备料、粉碎、浸提、浓缩、甲酯化反应、配位剂
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硼砂反应、大孔树脂色谱分离纯化、浓缩、萃取、洗涤、浓缩、得角鲨烯粗油和二氧化碳超临界萃取，即得角鲨烯含量≥80%角鲨烯精油。中国专利CN113604512A的说明书中公开了一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的工艺，其流程为在发酵液中加入碱性蛋白酶，对裂殖壶菌进行酶解破壁；在破壁后的菌液中加入无水乙醇，经振荡离心分离除去上清液水
‑
乙醇相，收集底层菌泥；在底层菌泥中加入正己烷，振荡离心收集上清液，重复若干次，直到上清液无色透明，最后蒸发去除正己烷，收集得到角鲨烯粗品；将角鲨烯粗品进行脱胶、脱酸、漂白和脱臭处理，得到纯化的角鲨烯。上述两种方式虽然都能够获得角鲨烯产品，但是工艺步骤比较繁琐、工艺周期较长、所得角鲨烯纯度相对较低、成本较高。
[0011]单从提取纯度上来，现有技术虽然能够获得角鲨烯，纯度也有过到96%，如上述专利中所公开一样。但目前还没有角鲨烯的提取纯度为97%及以上的方法，且提取纯度从96%提高到97%及以上是困难。因为各种角鲨烯来源宿主本身含有许多和角鲨烯性质极为相似的物质，通过多种方法都很难将其分开，方法条件极为苛刻，或成本极高无法大规模制备。

技术实现思路

[0012]为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，工艺简单、回收率高和产品纯度较高，纯度上可在97%以上，且也可以达到100%的纯度；并且避免了有机试剂的使用，大大节约了成本，绿色生态环保，极易实现产业化和推广。
[0013]解决以上技术问题的本专利技术中的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，包括以下步骤：（1）酿酒酵母发酵液准备；（2）离心后菌体洗涤：离心收集菌体，再加入蒸馏水重悬洗涤菌体，离心后再收集沉淀；（3）高压均质破碎：加入破碎提取液与沉淀混合，搅拌均匀后使用高压均质机进行破碎；高压均质破碎提取，破碎效果好，提取效率高。
[0014]（4）两相萃取旋蒸：充氮搅拌提取，取液相过滤后静置分层，再取有机相组分进行减压蒸馏，去除有机溶剂得粗提物；加入正相平衡液溶解后即为正相样品；正相色谱条件分离效果较好，回收率较高。
[0015]（5）柱层析和旋蒸：正相制备层析，按层析柱体积5
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10%比例上样并分段收集各组分，检测结果符合要求的目的组分混合后旋蒸去除有机试剂；检测结果符合要求为GC检测
纯度大于97%；（6）除菌过滤即得。
[0016]所述步骤（3）中沉淀与破碎提取液的质量体积比为1：1
‑
10。
[0017]优化方案中沉淀与破碎提取液的质量体积比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。
[0018]所述步骤（3）中破碎提取液为纯化水和有机试剂的混合液，所述有机试剂为正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚，纯化水和有机试剂按1：1或1：2或1：3或1：4或1:5比例进行配制。破碎提取液能够有效将目的物与其它水溶性杂质分开。
[0019]所述步骤（4）中两相萃取旋蒸具体为：充氮搅拌提取，取液相过滤后静置分层，提取离心过滤上清加入旋蒸瓶减压蒸馏，50
‑
60℃、50r/min旋4
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6min，优化方案中55℃、50r/min旋5min，有机试剂全部旋出后得粗提物；加入二氯甲烷，混匀后加入纯化水90ml，混匀后静置分层，取下层二氯甲烷相加入旋蒸瓶中减压蒸馏，50
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60℃、50r/min旋4
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6min，优化方案中55℃、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）酿酒酵母发酵液准备；（2）离心后菌体洗涤：离心收集菌体，加入蒸馏水重悬洗涤菌体，再离心收集沉淀；（3）高压均质破碎：加入破碎提取液与沉淀混合，充氮搅拌均匀后用高压均质机进行破碎；（4）两相萃取旋蒸：充氮搅拌提取，取液相过滤后静置分层，取有机相组分进行减压蒸馏，去除有机溶剂得粗提物；再加入正相平衡液溶解后即为正相样品；（5）柱层析和旋蒸：选用正相制备层析，按层析柱体积5%
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10%比例上样并分段收集各组分，检测结果符合要求的目的组分混合后旋蒸去除有机试剂；（6）除菌过滤即得。2.根据权利要求1所述的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中沉淀与破碎提取液的质量体积比为1：1
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10；优化方案中沉淀与破碎提取液的质量体积比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。3.根据权利要求1或2所述的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：所述破碎提取液为纯化水和有机试剂的混合液,所述有机试剂为正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚；优化方案中，纯化水和有机试剂按1：1或1：2或1：3或1：4或1:5比例进行配制。4.根据权利要求1中所述的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中正相平衡液为0.1
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99.9%正己烷
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99.9
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0.1%乙酸乙酯。5.根据权利要求4中所述的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：所述正相平衡液为99%正己烷
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1%乙酸乙酯。6.根据权利要求1所述的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（5）的内容替换为烘干菌体、超临界萃取以及分子蒸馏步骤，具体为加入破碎液与沉淀混合，搅拌均匀后使用高压均质机进行破碎；破碎后的菌体干燥；干燥后所得干菌再依次经二氧化碳超临界萃取、过滤和分子蒸馏。7.根据权利要求6所述的一种生物合成角鲨烯的提取纯化方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立宪，刘腾飞，王海龙，刘洪波，刘晓满，王雅君，何晓燕，李晓君，
申请(专利权)人：北京华诺泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：