一种定量检测重组带状疱疹疫苗或制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，尤其涉及一种定量检测重组带状疱疹疫苗或

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种定量检测重组带状疱疹疫苗或
/
和原液比活性的方法
。

技术介绍

[0002]水痘
‑
带状疱疹病毒
(varicella zoster virus
，
VZV)
属疱疹病毒亚科，即人疱疹病毒3型，是双链
DNA
病毒，病毒颗粒
150~200nm
，病毒糖蛋白
E(gE)
是宿主免疫系统识别的最主要糖蛋白
。VZV
的初次感染一般发生在幼儿期，以水痘为其主要临床表现
。
该病毒有极高的自然感染率，据报道全世界＞
50
岁人群中约
99%
的血清
VZV
呈阳性反应
。
病毒感染人体后潜伏于机体神经节的神经元内，呈隐匿性感染
。
当机体免疫力下降时，病毒再次活化并大量复制，可在周围感觉神经及该神经所支配的单侧皮节发生免疫反应，引起以红斑
、
簇集分布的水疱以及神经痛为主要特征的带状疱疹，接种带状疱疹疫苗能有效的预防带状疱疹发病率
。
[0003]目前，国内尚无自主研发的重组带状疱疹疫苗上市，且并未收录于
《
中国药典
》
中
。
通过对中英文专利检索，并未发现明确地应用竞争
ELISA
法测定重组带状疱疹疫苗及其原液的比活性专利，因此在重组带状疱疹疫苗的研制过程中，急需建立一种有效测定带状疱疹疫苗及原液的比活性检测方法，适用于产品比活性的放行
。
[0004]中国专利
CN 110231481
的说明书中记载了一种水痘
‑
带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法，在传统的
VZV
抗原的双抗体夹心
ELISA
检测方法的基础上，通过增加已知滴度的
VZV
样品进行定量标定，绘制
VZV
抗原含量滴度曲线，来测定水痘
‑
带状疱疹病毒的病毒滴度，该检测方法操作简单快捷，相对传统的
pfu
测定方法，极大提高了水痘带状疱疹病毒滴度的检测效率，特别适用于的病毒快速测定
。
但这个专利中检测方法不能定量准确测定比活性值，无法确定性的确定重组带状疱疹疫苗产品是否放行
。

技术实现思路

[0005]为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种定量检测重组带状疱疹疫苗或
/
和原液比活性的方法，能够定量的准确检测出比活性，操作简单，有良好的稳定性和重现性，适用于带状疱疹疫苗及其原液比活性的检测
。
[0006]解决以上技术问题的本专利技术中的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或
/
和原液比活性的方法，包括以下步骤：（1）准备待检样品和
VZV
免疫球蛋白抗体；（2）包被抗原和抑制：用稀释的
gE
蛋白包被酶标板，同时将不同稀释倍数的待检样品与
VZV
免疫球蛋白等体积混合形成抑制混合物；（3）封闭加样：将经过包被好的酶标板进行封闭，再向封闭好的酶标孔中加入抑制混合物进行反应；
（4）加二抗及显色：将经过
HRP
标记的二抗加入所述步骤（3）中反应完成的酶标板，再加入
TMB
底物显色液，终止后用酶标仪读
OD
450
‑
630
值；（5）确定比活性值：以已知浓度梯度的标准品做四参数拟合曲线，计算待检样品的
IC
50
值；根据此时
VZV
国际标准品浓度及稀释倍数，计算待检样品比活性（
IU/mg
），公式（Ⅰ）如下：，其中，
C
VZV
为
VZV
抗体起始浓度，
V
VZV
为
VZV
加样体积，
D
VZV
为
VZV
抗体稀释倍数，
IC
50
为抑制
VZV
抗体
50%
时
gE
抗原浓度，
V
IC50
为
IC50
处蛋白加样体积
。
[0007]IC
50
值为比活性计算中的一个指标，其计算过程为：
Excel
计算抑制率，不添加抑制物质（此对照孔中混合物中不含游离的
gE
蛋白，即
VZV
免疫球蛋白直接与固相上的
gE
抗原结合）的对照孔的
OD
值为
B0
，添加抑制物质的孔的
OD
值为
B
，
B/B0
称为抑制率
IC
，当抑制率为
50%
时，此时抑制物与
50%
的
VZV
抗体完全结合；再用
GraphPad Prism
软件分析
IC
50
，得
IC
50
值
。
[0008]所述人水痘
‑
带状疱疹免疫球蛋白为
WHO
国际标准品
W1044。
[0009]所述步骤（5）中标准品也为“人水痘
‑
带状疱疹免疫球蛋白”，来自于
WHO
国际标准品，货号为
W1044。
[0010]所述步骤（2）中包被过程包括：用稀释至2μ
g/mL
的
gE
蛋白按
100
μ
L/
孔加入酶标板中，2‑
8℃
过夜；所述抑制过程包括：待检品的起始浓度为2μ
g/mL
，按2倍系列稀释至
10
个梯度，人水痘
‑
带状疱疹免疫球蛋白稀释度为
1000
倍或
5000
倍，两者等体积混合后，2‑
8℃
过夜
。
[0011]所述步骤（3）中封闭过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，用
2%BSA
封闭，
300
μ
L/
孔，
37℃
封闭
2h。
[0012]所述步骤（3）中加样过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，将抑制混合物按
100
μ
L/
孔，室温孵育
1h。
[0013]所述步骤（4）中加二抗过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，用含...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种定量检测重组带状疱疹疫苗或
/
和原液比活性的方法，包括以下步骤：（1）准备待检样品和
VZV
免疫球蛋白抗体；（2）包被抗原和抑制：用稀释的
gE
蛋白包被酶标板，同时将不同稀释倍数的待检样品与
VZV
免疫球蛋白等体积混合形成抑制混合物；（3）封闭加样：将经过包被好的酶标板进行封闭，再向封闭好的酶标孔中加入抑制混合物进行反应；（4）加二抗及显色：将经过
HRP
标记的二抗加入反应完成的酶标板中，后加入
TMB
底物显色液，终止后用酶标仪读
OD
450
‑
630
值；（5）确定比活性值：以已知浓度梯度的标准品做四参数拟合曲线，计算待检样品的
IC50
值；根据此时
VZV
国际标准品浓度及稀释倍数，计算待检样品比活性（
IU/mg
），公式如下：，其中，
C
VZV
为
VZV
抗体起始浓度，
V
VZV
为
VZV
加样体积，
D
VZV
为
VZV
抗体稀释倍数，
IC
50
为抑制
VZV
抗体
50%
时
gE
抗原浓度，
V
IC50
为
IC50
处蛋白加样体积
。2.
根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或
/
和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（5）中
IC
50
计算过程为：计算抑制率，以不添加抑制物质的对照孔
OD
值为
B0
，添加抑制物质的孔
OD
值为
B
，
B/B0
即为抑制率
IC
，当抑制率为
50%
时，此时抑制物与
50%
的
VZV
抗体完全结合，再用
GraphPad Prism
软件分析
IC
50
，得
IC
50
值
。3.
根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或
/
和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（2）中包被过程包括：用稀释至2μ
g/mL
的
gE
蛋白按
100
μ
L/
孔加入酶标板中，2‑
8℃
过夜
。...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋力强，王海龙，付丽丽，
申请(专利权)人：北京华诺泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：