一种外泌体蛋白的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种外泌体蛋白的检测方法及检测试剂盒。采用磁珠法对外泌体裂解后的目标蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前去除检测液中与目标蛋白偶联的磁珠，然后进行外泌体目标蛋白的化学发光检测。检测试剂盒包括磁珠偶联试剂B、化学发光偶联试剂C、二硫键解离试剂、激发液，所述磁珠偶联试剂B为磁珠

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体蛋白的检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种外泌体蛋白的检测方法及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]外泌体(exosome)研究是最近几年比较火热的研究领域，众多学者对其进行不同角度、不同方法和应用的研究。而外泌体本身则是一种脂质双层膜结构的细胞外囊泡，直径大约30
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200nm左右，外泌体本身的产生则是通过出芽的方式从细胞膜表面分离出来，进入液体环境。由于外泌体个体小，可以在体液、血液等液体中流动传播。研究显示外泌体中含有许多与肿瘤相关的蛋白质，由于肿瘤类疾病对人类影响极大，人们对肿瘤的相关研究非常重视，而外泌体因其可以在体液中流动，可能携带许多与肿瘤发生发展、转移、侵袭及肿瘤微环境相关的蛋白质和其它相关生物成分，因此外泌体在肿瘤的诊疗研究中也有非常大的潜力。
[0003]外泌体中的内容物也非常丰富，如DNA、mRNA、lncRNA、cirRNA、mircroRNA、多种蛋白质等。外泌体表面有丰富的膜蛋白，如CD9、CD63、CD81等，外泌体内部也有非常多的蛋白质。由于脂质双层膜的保护作用，外泌体内的内容物比较稳定，不容易降解，其中有许多与肿瘤研究相关的蛋白质，尤其是临床用药指导相关的蛋白质，如PD
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L1蛋白、ALK蛋白、HER2蛋白等也有表达。在临床上这些蛋白质主要是通过肿瘤组织的免疫组化检测来鉴定其表达情况，进而用于用药指导，而在肿瘤组织不易取得的前提下，或者没办法取得肿瘤组织进行一系列的用药疗效监控和动态监控的前提下，如何发现可以用于临床无创检测、重复性检测和用药指导的蛋白质的检测载体和方法，这是目前比较关注的。所幸的是外泌体是比较符合这一要求的研究材料。外泌体表面表达PD
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L1蛋白、ALK蛋白、HER2蛋白等，因此在无创用药指导检测产品开发上，外泌体有着非常巨大的研究价值。
[0004]目前，对于外泌体蛋白的检测方法主要有免疫组织化学法检测、原位杂交法检测、实时荧光定量PCR、FISH、二代测序、Elisa法等。以外泌体HER2蛋白为例，在研究过程中使用Elisa检测方法我们发现裂解后的外泌体HER2蛋白比外泌体表面的HER2蛋白表达量更多，但是在对裂解以后的外泌体进行磁珠法化学发光检测HER2蛋白时发现裂解体系内的偶联磁珠对检测体系影响非常大。为了提高检测的灵敏性，使用化学发光法能够检测到外泌体总HER2蛋白表达情况，如何实现适量的血浆中高灵敏的外泌体总HER2蛋白检测，是目前需要解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种外泌体蛋白的检测方法及检测试剂盒。主要解决现有技术中外泌体膜上和膜内总蛋白检测灵敏度不高的技术问题。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]一种外泌体蛋白的检测方法，该方法为：采用磁珠法对外泌体裂解后的目标蛋白
进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前去除检测液中与目标蛋白偶联的磁珠，然后进行外泌体目标蛋白的化学发光检测。
[0008]作为优选实施方案，所述去除检测液中与目标蛋白偶联的磁珠的方法为：磁珠与二硫键偶联后再与目标蛋白抗体偶联，进行化学发光检测前使用二硫键解离试剂切掉二硫键，即去除掉磁珠。
[0009]作为优选实施方案，所述方法包括如下步骤：
[0010]步骤1，对外泌体进行裂解，将裂解液与磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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蛋白抗体1进行孵育，得到偶联复合物：磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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抗体1
‑
目标蛋白；
[0011]步骤2，将步骤1中制得的偶联复合物与抗体2
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发光标记物进行偶联，得到复合物：磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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抗体1
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目标蛋白
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抗体2
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发光标记物；
[0012]步骤3，将步骤2中得到的复合物采用二硫键解离试剂切掉二硫键，去除复合物中的磁珠，得到检测目标物：亲和素
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生物素
‑
抗体1
‑
目标蛋白
‑
抗体2
‑
发光标记物；
[0013]步骤4，将步骤3中得到的检测目标物采用化学发光法进行检测，通过检测发光值实现对目标蛋白的检测。
[0014]本专利技术中所述的抗体1、抗体2是指与目标蛋白免疫结合的两种不同表位的抗体，抗体不同，但是免疫结合的目标蛋白是同一个。
[0015]作为优选实施方案，所述亲和素为链霉亲和素。
[0016]作为优选实施方案，所述发光标记物为吖啶酯。
[0017]作为优选实施方案，所述目标蛋白为外泌体膜上和膜内都有表达的蛋白。
[0018]作为优选实施方案，所述目标蛋白为HER2蛋白、ALK蛋白、PD
‑
L1蛋白或CD9蛋白。
[0019]本专利技术还提供一种外泌体蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：磁珠偶联试剂B、化学发光偶联试剂C、二硫键解离试剂、激发液，所述磁珠偶联试剂B为磁珠
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二硫键
‑
亲和素
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生物素
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抗体1偶联物，所述化学发光偶联试剂C为抗体2
‑
发光标记物偶联物；所述磁珠偶联试剂B与样本中的目标蛋白结合，然后加入化学发光偶联试剂，在加入激发液进行检测之前加入二硫键解离试剂去除检测液中的磁珠。
[0020]作为优选实施方案，所述磁珠偶联试剂B的组成为：6.9
‑
9.9g/L的Tris，5.23
‑
8.79g/L的氯化钠，0.3
‑
0.8mg/mL的磁珠
‑
二硫键
‑‑
亲和素
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生物素
‑
抗体1偶联物，其中抗体1的浓度为0.2
‑
0.5μg/mL，PH:7.5
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8.0，溶剂为水。
[0021]作为优选实施方案，所述检测试剂盒包括：磁珠偶联试剂A(磁珠
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CD9抗体)，洗涤试剂Ⅰ，洗涤试剂Ⅱ，洗涤试剂Ⅲ，洗涤试剂Ⅳ，PBST缓冲液，PBS缓冲液，外泌体裂解液A，磁珠偶联试剂B(磁珠
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二硫键
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亲和素
‑
生物素
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抗体1)，化学发光偶联试剂C(抗体2
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AE)，二硫键解离试剂，激发液A液，激发液B液。所述亲和素优选为链霉亲和素(链霉亲和素)。
[0022]具体地，
[0023]所述洗涤试剂Ⅰ的组成为：终浓度为5.98
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体蛋白的检测方法，该方法为：采用磁珠法对外泌体裂解后的目标蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前去除检测液中与目标蛋白偶联的磁珠，然后进行外泌体目标蛋白的化学发光检测。2.如权利要求1所述的外泌体蛋白的检测方法，其特征在于，去除检测液中与目标蛋白偶联的磁珠的方法为：磁珠与二硫键偶联后再与目标蛋白抗体偶联，进行化学发光检测前使用二硫键解离试剂切掉二硫键，即去除掉磁珠。3.如权利要求1所述的外泌体蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1，对外泌体进行裂解，将裂解液与磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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蛋白抗体1进行孵育，得到偶联复合物：磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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抗体1
‑
目标蛋白；步骤2，将步骤1中制得的偶联复合物与抗体2
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发光标记物进行偶联，得到复合物：磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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抗体1
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目标蛋白
‑
抗体2
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发光标记物；步骤3，将步骤2中得到的复合物采用二硫键解离试剂切掉二硫键，去除复合物中的磁珠，得到检测目标物：亲和素
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生物素
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抗体1
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目标蛋白
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抗体2
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发光标记物；步骤4，将步骤3中得到的检测目标物采用化学发光法进行检测，通过检测发光值实现对目标蛋白的检测。4.如权利要求3所述的外泌体蛋白的检测方法，其特征在于：所述亲和素为链霉亲和素。5.如权利要求3所述的外泌体蛋白的检测方法，其特征在于：所述发光标记物为吖啶酯。6.如权利要求1
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3任一项所述的外泌体蛋白的检测方法，其特征在于：所述目标蛋白为外泌体膜上和膜内都有表达的蛋白。7.如权利要求6所述的外泌体蛋白的检测方法，其特征在于：所述目标蛋白为HER2蛋白、ALK蛋白、PD
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L1蛋白或CD9蛋白。8.一种外泌体蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：磁珠偶联试剂B、化学发光偶联试剂C、二硫键解离试剂、激发液，所述磁珠偶联试剂B为磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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抗体1偶联物，所述化学发光偶联试剂C为抗体2
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发光标记物偶联物；所述磁珠偶联试剂B与样本中的目标蛋白结合，然后加入化学发光偶联试剂，在加入激发液进行检测之前加入二硫键解离试剂去除检测液中的磁珠。9.如权利要求8中的检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠偶联试剂B的组成为：6.9
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9.9g/L的Tris，5.23
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8.79g/L的氯化钠，0.3
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0.8mg/mL的磁珠
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二硫键
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亲和素
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生物素
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抗体1偶联物，其中抗体1的浓度为0.2
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0.5μg/mL，PH:7.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵小玉，周海洋，马跃，蔡瑶，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：