基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，包括：采用免疫磁分离方法分离目标菌株，制备菌液；将菌液加载于微孔阵列芯片中，并应用微孔阵列芯片对目标菌株进行高通量药敏检测；其中，芯片上检测通道用于加载并检测含不同浓度的目标检测药物的菌液，所述菌液中含细菌指示剂；通过智能设备对微孔阵列芯片进行拍照判断菌株的药敏性和最低抑制浓度。本发明专利技术方法可有效整合不同的抗生素种类，实现高通量的药敏性检测，且可通过调整检测通道的数量，灵活控制抗生素的浓度范围和梯度，且可有效的缩短药敏检测时间，简化控制操作和设备集成，可应用于有限的资源条件。资源条件。资源条件。

【技术实现步骤摘要】
基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种细菌药敏性检测的方法，尤其是涉及基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法。

技术介绍

[0002]在传统的细菌药敏检测方法中，菌株分离培养为必要步骤，一般需要24
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48h才可得到供后续进行下一步检测的菌株。基于传统平板的纸片法或培养基梯度稀释法检测细菌药敏性是经典的药敏检测方法，但是需要大量的人工操作，且通常需要24
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48h才能得到检测结果(Matuschek,E.,et al.,Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories.2016,20(4):p.O255
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O266.)。为快速得到药敏检测结果则需要缩短包括前端分离培养所需要的时间。免疫磁分离方法则提供了从复杂的实际样品中分离特定菌株的可能。后端快速药敏检测方法包括基因型和表型两种方式。其中因表型检测方法能可靠且直观的判断出细菌是否生长，该方法依然是快速药敏检测的主流方法。但相较于可同时检测多种抗生素药敏性的基因型检测方法，基于表型检测主流方法的低通量特点限制了其对多种抗生素的药敏性检测的应用。液滴微流控是提高检测通量的一种有效方式，其中微孔阵列是液滴微流控的一种类型，它通过凹陷的微孔截留溶液，具有不依赖注射泵等高精密仪器设备即可形成大量独立的微液滴的特点(Azizi M,Zaferani M,Dogan B,et al.Nanoliter
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Sized Microchamber/Microarray Microfluidic Platform for Antibiotic Susceptibility Testing[J].Anal Chem,2018,90(24):14137
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14144.、Juskova P,Schmitt S,Kling A,et al.Real
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Time Respiration Changes as a Viability Indicator for Rapid Antibiotic Susceptibility Testing in a Microfluidic Chamber Array[J].ACS Sens,2021,6(6):2202
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2210.)。微孔阵列具有精细的构造，现有制造方式主要依赖光刻技术，费用昂贵且工艺复杂，限制了其广泛应用。3D打印技术的快速发展提供了一种可替代的低成本操作简便的制造方式，该技术的成功迁移可促进微孔阵列在药敏检测中应用。此外，后端的检测设备常需要荧光显微镜或拉曼光谱仪等大型仪器设备，不适用于条件有限的检测场景。因此，结合免疫磁分离和微孔阵列板，开发一种可实现不同浓度梯度的高通量且不依赖大型设备的快速药敏检测新方法具有重要的研究意义及实用价值。

技术实现思路

[0003]现有基于表型的细菌药敏性快速检测方法不能有效缩短前端菌株分离时间，且常依赖于大型仪器设备(荧光显微镜或拉曼光谱等)。本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法。
[0004]本专利技术采用的技术方案如下：
[0005]一种基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，包括：
[0006]采用免疫磁分离方法分离目标菌株，制备菌液；将菌液加载于微孔阵列芯片中，并应用微孔阵列芯片对目标菌株进行高通量药敏检测；其中，所述微孔阵列芯片上包括一个或多个微孔阵列单元，每个所述微孔阵列单元中包括若干列检测通道，所述检测通道用于加载并检测含不同浓度的目标检测药物的菌液，所述菌液中含细菌指示剂；
[0007]通过智能设备对微孔阵列芯片进行拍照判断菌株的药敏性和最低抑制浓度。
[0008]上述技术方案中，进一步地，采用免疫磁分离方法分离目标菌株，制备菌液，具体包括：将细菌过夜培养，然后用免疫磁珠进行捕获，后使用添加有细菌指示剂的药敏培养基对磁珠捕获的细菌重悬富集。
[0009]进一步地，所述微孔阵列芯片为亲水性芯片。
[0010]进一步地，所述微孔阵列芯片包括多个微孔阵列单元，且相邻微孔阵列单元的间距与移液枪排枪中相邻吸头间距相同。
[0011]进一步地，每个所述微孔阵列单元中，每列检测通道包括载样区和检测区，载样区位于检测区端部，在检测区沿通道依次设有若干微孔，所述微孔阵列单元还包括液体缓冲区域，设在各检测通道末端，液体缓冲区域中填充吸水棉。
[0012]进一步地，每个检测通道为宽
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深尺寸为0.45mm
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0.2mm的凹槽，在凹槽内沿通道长度方向均匀设置微孔，微孔半径R＝0.2mm深度H＝0.24mm，加载的菌液初始浓度量级为105CFU/mL。
[0013]进一步地，取菌液分别加载到各检测通道内，对每个所述微孔阵列单元加载菌液时目标检测药物的浓度按所述微孔阵列单元中检测通道列的顺序呈梯度变化，菌液在检测通道中被通道内微孔截留，多余的溶液被吸水棉吸收，样品加载完成后，丢弃吸水棉，然后覆盖矿物油用以防止溶液挥发。
[0014]进一步地，将加载菌液后的微孔阵列芯片放置恒温培养箱培养，5
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6h后，利用智能设备拍照以观察不同检测通道内细菌指示剂的颜色变化，如细菌指示剂采用刃天青，刃天青继续保持为蓝色说明菌株被抑制生长，如果显示为红色则表明正常生长，以此来判断测试菌株对所测药物的敏感性、确定最低抑制浓度和进行药敏性评级。所述的细菌指示剂还可以为中性红等指示剂。
[0015]本专利技术方法结合免疫磁分离、微孔阵列板及智能设备于一体。在每个微孔阵列单元创新性整合了不同抗生素以及多种浓度的组合可进行高通量细菌药敏性检测。结合细菌指示剂和智能设备可在5小时左右报告细菌药敏性检测结果。该微孔阵列板集成浓度梯度可提高药敏性检测通量，独立的微孔可避免实验交叉污染，简化设备集成，对提高细菌药敏检测的时效，简化实验操作等具有重要意义。相较于基于荧光显微镜和拉曼光谱等其它基于表型的细菌药敏检测方法，有益效果如下：
[0016](1)对群落中低浓度目标菌株的特异性分离：利用免疫磁珠对群落中低浓度目标菌株直接进行分离后在微孔阵列芯片上进行抗生素敏感性测试，缩短菌株抗生素敏感性测试的总周转时间。
[0017](2)微孔阵列芯片的设计与应用：本专利技术中采用微孔阵列芯片中微孔顺利填充样品溶液形成微液滴，同时对若干个微孔信号的收集可实现对菌株的高通量抗生素敏感性检测。
[0018](3)该微孔阵列芯片上的药物浓度梯度具有良好的可调节性：可通过微孔阵列单
元内监测通道的数量，调节得到更密集或稀疏的浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，其特征在于，包括：采用免疫磁分离方法分离目标菌株，制备菌液；将菌液加载于微孔阵列芯片中，并应用微孔阵列芯片对目标菌株进行高通量药敏检测；其中，所述微孔阵列芯片上包括一个或多个微孔阵列单元，每个所述微孔阵列单元中包括若干列检测通道，所述检测通道用于加载并检测含不同浓度的目标检测药物的菌液，所述菌液中含细菌指示剂；通过智能设备对微孔阵列芯片进行拍照判断菌株的药敏性和最低抑制浓度。2.根据权利要求1所述的基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，其特征在于，采用免疫磁分离方法分离目标菌株，制备菌液，具体包括：将细菌过夜培养，然后用免疫磁珠进行捕获，后使用添加有细菌指示剂的药敏培养基对磁珠捕获的细菌重悬富集。3.根据权利要求1所述的基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，其特征在于，所述微孔阵列芯片为亲水性芯片。4.根据权利要求1所述的基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，其特征在于，所述微孔阵列芯片包括多个微孔阵列单元，且相邻微孔阵列单元的间距与移液枪排枪中相邻吸头间距相同。5.根据权利要求1所述的基于磁分离和微孔阵列的细菌药敏性快速高通量检测方法，其特征在于，每个所述微孔阵列单元中，每列检测通道包括载样区和检测区，载样区位于检测区端部，在检测区沿通道依次设有若干微孔，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠峰，张慧林，张璐，
申请(专利权)人：西湖大学，
类型：发明
国别省市：