一种鉴定水牛角的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定水牛角的方法。本发明专利技术发现了水牛、黄牛及牦牛线粒体基因位点的差异，水牛线粒体基因中，所述线粒体基因的登录号为MT237632.1，其第5380位核苷酸为G、其第5378位核苷酸为T、其第5377位核苷酸为C、其第5374位核苷酸为G。根据差异位点设计了鉴定水牛角的特异性引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示。本发明专利技术所述的水牛角的鉴定方法，包括以下步骤：采集待测牛角样品，提取待测牛角样品中的DNA，利用特异性引物对进行PCR检测，能得到250bp特异性扩增片段的即为水牛角，反之则不是水牛角。本发明专利技术的特异性引物对在PCR检测中可以准确鉴别出水牛角，鉴定方法稳定，特异性强，且不受药材性状影响，可以对药材及切制后的饮片进行准确鉴别。制后的饮片进行准确鉴别。制后的饮片进行准确鉴别。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定水牛角的方法


[0001]本专利技术涉及一种鉴定水牛角的方法，属于药物分析


技术介绍

[0002]水牛角为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角，药用始载于《名医别录》，列为中品，“可疗时气寒热头痛”。现代研究表明，水牛角主要含有蛋白质类、肽类、氨基酸类、含硫类、核苷类、无机元素等化合物，具清热凉血，解毒，定惊之功效。中医临床常用水牛角及其方剂治疗热证，疗效确切。水牛角因其与犀牛角有相似和确切的功效，被作为犀牛角的替代品，随着人们对水牛角及其配方中成药的认可，资源应用日趋广泛。水牛角在我国大部分地区均饲养，以南方水稻地区较多。经调研，市售水牛角的商品规格以水牛角丝、水牛角尖等为主，缺乏完整性状鉴定特征，难以准确鉴定到物种，市售水牛角中有将牦牛角和黄牛角作为水牛角销售的现象，且占比较大，因此，急需建立一种能够准确鉴定水牛角基原的方法。
[0003]关于水牛角及其近似品的鉴别研究，画红顺比较羚羊角和水牛角薄层色谱图，结果表明，羚羊角和水牛角所显示的斑点颜色和位置均相同，无明显区别。李晓蒙等采用HPLC法鉴别水牛角与羚羊角，结果表明，水牛角和羚羊角的氨基酸种类与水牛角的氨基酸种类基本一致，但氨基酸含量有较大的差异。唐慧英等采用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)并结合二阶导数谱分析鉴别鹿茸、鹿角、羚羊角、水牛角4种角类动物药，结果表明，水牛角和羚羊角在红外原始谱图和导数光谱相似性都很大，从峰强度看，羚羊角集中成分的含量高于水牛角。刘旭朝以CO I序列为DNA条形码，取水牛角及其易混品样品，建立基于DNA条形码技术的水牛角及其易混伪品鉴定方法。刘睿等
[i]采用数学几何与Label free定量多肽组学分析筛选，确定3条牛角特征肽段，水牛角样品可检出特征肽1和3，黄牛角可检出特征肽1与2，牦牛角可检出特征肽2与3。
[0004]《中国药典》2020年版水牛角项下仅有性状与粉末显微鉴别项，动物药材大多外形已破坏、显微特征不明显、化学成分特异性不强，上述方法无法对水牛角及其近缘种进行区分。
[0005]以上鉴别方法仍存在专属性不强、检测灵敏度不高或成本较高的缺点。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供线粒体基因位点及其应用。本专利技术的第二目的是提供一种基于线粒体基因位点设计的特异性引物对及其应用。
[0007]技术方案：本专利技术所述的线粒体基因在鉴定水牛角中的应用，所述线粒体基因的登录号为MT237632.1，其第5380位核苷酸为G、其第5378位核苷酸为T、其第5377位核苷酸为C、其第5374位核苷酸为G。
[0008]本专利技术所述的线粒体基因在区分水牛角、黄牛角和/或牦牛角中的应用，所述线粒体基因的登录号为MT237632.1，其第5380位核苷酸为G、其第5378位核苷酸为T、其第5377位
核苷酸为C、其第5374位核苷酸为G时，待测药材为水牛角；当其第5380位核苷酸为A、其第5378位核苷酸为C、其第5377位核苷酸为T、其第5374位核苷酸为T时，待测药材为黄牛角或牦牛角。
[0009]本专利技术所述的基于上述线粒体基因设计的特异性引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
[0010]本专利技术所述的水牛角的鉴定方法，包括以下步骤：采集待测牛角样品，提取待测牛角样品中的DNA，上述的特异性引物对进行PCR检测，能得到250bp特异性扩增片段的即为水牛角，反之则不是水牛角。
[0011]进一步地，所述待测牛角样品包括水牛角、黄牛角、牦牛角。
[0012]进一步地，所述待测牛角样品类型包括牛角药材、饮片。
[0013]进一步地，所述PCR检测的体系包括10
×
Fast buffer I、dNTP、特异性引物、Speed STAR HS Taq DNA聚合酶、DNA模板、无菌水。
[0014]进一步地，所述DNA模板浓度为10
‑
100ng/μL。
[0015]进一步地，所述PCR检测的反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s共33个循环，72℃终延伸5min。
[0016]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本专利技术的特异性引物对在PCR检测中可以准确鉴别出水牛角，鉴定方法稳定，特异性强，且不受药材性状影响，可以对药材及切制后的饮片进行准确鉴别。
附图说明
[0017]图1是在NCBI基因库中下载的3种牛角的线粒体基因组DNA序列对比图。
[0018]图2是实验所涉及到的部分水牛角、黄牛角、牦牛角样品的序列位点比对图。
[0019]图3是引物不同退火温度考察图，其中，1.SNJ01(水牛角)、2.SN02(水牛角)、3.HN01(黄牛角)、4.HN02(黄牛角)、5.MN01(牦牛角)、6.MN02(牦牛角)、N.无菌水、M.100
‑
2000bp marker。
[0020]图4是不同聚合酶考察图，其中，1.SNJ01(水牛角)、2.SN02(水牛角)、3.HN01(黄牛角)、4.HN02(黄牛角)、5.MN01(牦牛角)、6.MN02(牦牛角)、N.无菌水、M.100
‑
2000bp marker。
[0021]图5是不同循环数考察图，其中，1.SNJ01(水牛角)、2.SN02(水牛角)、3.HN01(黄牛角)、4.HN02(黄牛角)、5.MN01(牦牛角)、6.MN02(牦牛角)、N.无菌水、M.100
‑
2000bp marker。
[0022]图6是不同模板量考察图，其中，1.SNJ01(水牛角)、2.SN02(水牛角)、3.HN01(黄牛角)、4.HN02(黄牛角)、5.MN01(牦牛角)、6.MN02(牦牛角)、N.无菌水、M.100
‑
2000bp marker。
[0023]图7是药材适应性考察图，1
‑
23为水牛角、24
‑
31为黄牛角、32
‑
38为牦牛角。
具体实施方式
[0024]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0025]实施例1
[0026]1、仪器与样品
[0027]1.1仪器
[0028]电热恒温水浴锅(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)、离心机(赛默飞世尔科技有限公司)、高通量组织研磨器(遂真生物科技有限公司)、灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、PCR仪(美国伯乐生物科技有限公司)、WIX电泳系统(韦克斯科技有限公司)、凝胶成像系统(美国Azure生物科技有限公司)
[0029]1.2试剂
[0030]血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)、Taq DNA聚合酶(ET101)、GenRed核酸染料(RT211)均购自天根生化科技有限公司，蓝色超快Taq酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.线粒体基因在鉴定水牛角中的应用，其特征在于，所述线粒体基因的登录号为MT237632.1，其第5380位核苷酸为G、其第5378位核苷酸为T、其第5377位核苷酸为C、其第5374位核苷酸为G。2.线粒体基因在区分水牛角、黄牛角和/或牦牛角中的应用，其特征在于，所述线粒体基因的登录号为MT237632.1，其第5380位核苷酸为G、其第5378位核苷酸为T、其第5377位核苷酸为C、其第5374位核苷酸为G时，待测药材为水牛角；当其第5380位核苷酸为A、其第5378位核苷酸为C、其第5377位核苷酸为T、其第5374位核苷酸为T时，待测药材为黄牛角或牦牛角。3.一种基于权利要求1所述的线粒体基因设计的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示。4.一种水牛角的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：采集待测牛角样品，提取待测牛角样品中的DNA，利用权利要求3所述的特异性引物对进行PCR检测，能得到250bp特异性扩增片段的即为水牛角，反...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海琴，钱润，陈盛君，李松，张开雪，浦香兰，曹杰楠，程梦娟，海丰，胡剑虹，
申请(专利权)人：江阴天江药业有限公司，
类型：发明
国别省市：