一种基于环境DNA的长江鲟引物、探针及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于环境DNA的长江鲟引物、探针及检测方法，上游引物CJX

【技术实现步骤摘要】
一种基于环境DNA的长江鲟引物、探针及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于环境DNA的长江鲟实时荧光PCR扩增引物和探针及其检测方法。

技术介绍

[0002]长江鲟(Acipenser dabryanus)又名达氏鲟，属于鲟形目(Acipenseriformes)、鲟科(Acipenseridae)、鲟属(Acipenser)，是淡水定居性鱼类，一般只在栖息江段进行短距离移动，历史上其主要栖息地是金沙江下游至长江上游，同时在乌江、嘉陵江、渠江、沱江、岷江等长江大型支流的下游也有分布。长江鲟作为长江三大鲟鱼之一，是上世纪70年代的主要经济鱼类，而近几十年来，长江鲟的野生种群数量已急剧下降到极低水平，被列为国家一级保护动物。受到调查人员专业背景和物种本身资源量已经处于极少状态的限制，长江鲟的生物学信息获取的准确性和信息量很有限，对它的分布范围和种群情况尚不清楚，再加上长江干流2020年起禁止捕捞十年，使得直接监测和评估长江鲟种群愈发困难，因此建立长江鲟的快速准确鉴定方法十分必要。目前没有针对长江鲟环境DNA的实时荧光鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种高灵敏度的基于环境DNA的长江鲟实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物。
[0004]本专利技术的另一目的在于提供上述基于环境DNA的长江鲟的检测方法。
[0005]本专利技术的又一目的在于提供上述基于环境DNA的长江鲟的检测试剂盒。
[0006]本专利技术目的通过如下技术方案实现：
[0007]一种长江鲟实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增引物的上游引物为CJX
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F2、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物为CJX
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R2、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为CJX
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P2、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0008]上述长江鲟实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物的制备方法是根据长江鲟的线粒体DNA(mtDNA)中筛选的特异性高的基因序列设计，并建立了长江鲟环境DNA的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定长江鲟的目的。
[0009]采用上述组合物对基于环境DNA的长江鲟的的检测方法，其特征在于：上述实时荧光PCR扩增体系优选为20μL，包括10μL Probe qPCR Mix,with UNG(2
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)(市售产品)，上下游引物CJX
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F2和CJX
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R2各0.4μL，浓度为10μmol/L，CJX
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P2探针0.8μL，浓度为10μmol/L，DNA模板2μL，ddH2O 6.4μL。
[0010]进一步的，上述实时荧光PCR反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，60℃30sec循环44次。
[0011]一种检测长江鲟的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下引物和探针：上游引物
CJX
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F2核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物CJX
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R2核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针CJX
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P2核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]本专利技术具有如下有益效果：
[0013]原有长江鲟鉴定方法需要依靠鉴定者的经验，完全由人工判定，影响鉴定准确率，本专利技术基于环境DNA检测长江国家一级保护动物长江鲟的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，建立了长江鲟的实时荧光PCR检测方法。检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测，监测结果精确，优于人为直观判定结果。
[0014]长江鲟与其同科鱼类在分子水平上的差异也较小，探针选择不好会有假阳性扩增，探针的设计需高度保守，理论上一个碱基不同就有可能不能匹配，这对长江鲟实时荧光特异性探针的设计造成一定难度，且不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响。本专利技术在最终确定方法时，通过比对较长的长江鲟线粒体全序列DNA，发现特异性高的基因序列、以此为模板设计了扩增效率高的CJX
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F2/CJX
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R2作为扩增引物，经大量试验验证，长江鲟特异性引物CJX
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F2/CJX
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R2和探针CJX
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P2相结合具有特异性好、灵敏度高的特点，可特异性检测长江鲟DNA，有效区分长江鲟和其他鲟科鱼类，检测的最低长江鲟eDNA的拷贝数为6.74、检测的最低DNA浓度可达1.05
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‑5ng/uL。特异性有引物和探针双重保证，为长江鲟的鉴定提供了一种新方法，无需采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤，检测准确度高，分析简单快捷，可用于长江鲟的快速鉴定。有利于反映出长江鲟在不同样点的生物量及时空动态，从而为长江禁渔大背景下长江鲟的人工放流效果评价和资源管理保护提供参考。
附图说明
[0015]图1：本专利技术引物CJX
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F2/CJX
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R2和探针CJX
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P2在长江鲟的mtDNA上的位置。图2：本专利技术应用引物CJX
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F2/CJX
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R2和探针CJX
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P2对长江鲟和其他鱼类样品实时荧光PCR扩增的结果。
[0016]图3：本专利技术长江鲟样品DNA构建的质粒进行10倍梯度稀释后经实时荧光PCR测定的荧光信号曲线图。
具体实施方式
[0017]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0018]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
[0019]实施例1
[0020]长江鲟环境DNA的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
[0021]1.设计引物和探针。
[0022]根据长江鲟的线粒体DNA(mtDNA)中高特异性的基因序列设计如下引物CJX
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长江鲟实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增引物的上游引物为CJX
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F2、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物为CJX
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R2、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为CJX
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P2、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。2.采用如权利要求1所述组合物对长江鲟的检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增体系优选为20μL，包括Probe qPCR Mix,with UNG(2
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)(TaKaRa市售产品)10μL，上下游引物CJX
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F2/CJX
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【专利技术属性】
技术研发人员：何文平，姚维志，张连博，曹明松，陈莎莎，李泽昊，胡家雯，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：