长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用。所述长林小蠹特异性引物包含CLSSF2和CLSSR4，所述CLSSF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CLSSR4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术基于所述长林小蠹特异性引物，构建了长林小蠹的分子快速鉴定技术体系，利用分子生物学手段，能快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定。将本发明专利技术提供的长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒用于国内外苗木调运、货物运输等检疫工作中长林小蠹的快速检测，灵敏度高，特异性强，有助于提高检疫部门的工作效率。有助于提高检疫部门的工作效率。有助于提高检疫部门的工作效率。

【技术实现步骤摘要】
长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]长林小蠹(Hylurgus ligniperda Fabricius)隶属鞘翅目(Coleoptera)象虫科(Curculionidae)小蠹亚科(Scolytinae)，切梢小蠹族(Tomicini)林小蠹属(Hylurgus Latreille)，又名红毛小蠹(red
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haired pine bark beetle)，是国际重大林业检疫性害虫。长林小蠹寄主范围广、扩散能力强，严重威胁林业发展及生物安全。长林小蠹可危害松属Pinus、落叶松属Larix、云杉属Picea等诸多针叶树种，通过取食、钻蛀坑道等方式影响林木生长。同时，该物种还可携带并传播多种微生物和线虫等病原体，如松树黑根病菌、蓝变菌、伞滑刃属线虫(Bursaphelenchu spp.，与松材线虫为同一属)等，引发受害木主干以及根部的多种病害，导致树势衰退甚至树木死亡。长林小蠹的生活史隐蔽，扩散和入侵能力强。该物种主要生活于树皮内层和木质部之间，易随木材贸易进行大面积传播，是我国及世界各国在松树进口原木中截获最多的昆虫之一。同时，长林小蠹成虫的飞行能力强且适生环境广，随风飞行速度可高达2m/s，在除南极洲外各个大洲均有适生区分布。目前，长林小蠹已从起源地欧洲散至整个欧洲以及亚洲、非洲、美洲的部分国家和地区。2019年，在山东省烟台市首次发现在我国入侵并严重危害，此后，威海、泰安、青岛、日照等地不断有新的疫区被发现，被预测具有较高的进一步扩散风险。
[0003]植物检疫和早期监测，是防止外来有害生物入侵和扩散的最有效的手段。在实际工作中，为了将长林小蠹和国内常见小蠹类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的小蠹类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的分类特征。
[0004]近些年，分子生物学的快速发展已为昆虫快速准确地鉴定提供了强有力的技术支撑。目前，针对长林小蠹的分子鉴定需要利用昆虫通用引物对DNA进行扩增，将产物送至基因检测公司进行核酸测序，获得测序结果后与数据库进行比对，最终经过软件分析和人工判读后明确是否为长林小蠹。此方法检测周期长，需要借助第三方公司完成，且对操作人员的技术水平有较高的要求，限制了其在海关检疫和林业部门的应用。目前尚未有准确高效的分子快速鉴定技术的报道。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于利用分子生物学手段，快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定，特别是除成虫以外其它虫态(卵、幼虫和蛹)的鉴定。
[0007]具体的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供了长林小蠹特异性引物，所述长林小蠹特异性引物包含
CLSSF2和CLSSR4，所述CLSSF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CLSSR4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]本专利技术以长林小蠹为靶标，以纵坑切梢小蠹、横坑切梢小蠹、红脂大小蠹和华山松大小蠹为参照，设计得到了一组基于线粒体COⅠ基因序列的种特异性引物CLSSF2/CLSSR4。线粒体DNA严格母系遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(CO I)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。经验证，本专利技术提供的引物CLSSF2/CLSSR4具有极强的特异性，能快速、准确地实现针对检疫性害虫长林小蠹的鉴定，灵敏度高。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种用于检测长林小蠹的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述的长林小蠹特异性引物。
[0011]优选的，所述试剂或试剂盒还包含样品基因提取试剂、2
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Taq Plus PCR MasterMix、无菌去离子水、阳性对照品中的至少一种。
[0012]基于所述的长林小蠹特异性引物的序列特点，本专利技术提供的用于检测长林小蠹的试剂或试剂盒在长林小蠹的检测中能同样发挥良好的特异性和检测灵敏度。
[0013]第三方面，本专利技术提供了所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒在检测长林小蠹中的应用。
[0014]进一步的，本专利技术还具体提供了一种检测长林小蠹的方法，使用所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒。
[0015]优选的，所述检测长林小蠹的方法包括如下步骤：
[0016]S1、提取待测样本的基因组DNA；
[0017]S2、以所述待测样本的基因组DNA为模板，以所述CLSSF2和CLSSR4为引物，进行PCR扩增；
[0018]S3、分析PCR扩增产物。
[0019]进一步优选的，步骤S2所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括12μL MIX，1μL上游引物CLSSF2，1μL下游引物CLSSR4，1μL基因组DNA模板和10μL ddH2O；
[0020]优选的，在所述反应体系中，MIX的浓度为2X，上游引物CLSSF2的浓度为100Pmol/μl，下游引物CLSSR4的浓度为100Pmol/μl，基因组DNA模板的浓度为20ng/μl。
[0021]进一步优选的，步骤S2所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸5min。
[0022]进一步优选的，步骤S3所述分析PCR扩增产物的方法为：若所述PCR扩增得到261bp的条带，则判断所述待测样本的来源为长林小蠹。
[0023]本专利技术利用所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒检测长林小蠹，建立了基于SS
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CO I(Species
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Specific CO I,SS
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CO I)的长林小蠹的分子快速鉴定技术体系：首先提取小蠹样本的基因组DNA，后运用普通PCR的方法，经琼脂糖凝胶电泳显像，即可实现对长林小蠹快速准确地鉴定。
[0024]本专利技术提供的检测长林小蠹的方法，可用于国内外苗木调运、货物运输等检疫工作中长林小蠹的快速检测。整个鉴定周期仅需2
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3h，有助于提高检疫部门的工作效率。
[0025]第四方面，本专利技术还提供了所述特异性引物，或者所述的试剂或试剂盒，或者所述检测长林小蠹的方法在区分长林小蠹和其他小蠹科昆虫中的应用，所述其他小蠹科昆虫包括如下至少一种：纵坑切梢小蠹、横坑切梢小蠹、红脂大小蠹、华山松大小蠹。
[0026]有益效果：
[0027]本专利技术提供了一种长林小蠹特异性引物、试剂、试剂盒及应用。所述长林小蠹特异性引物包含CLSSF2和CLSSR4，所述CLSSF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CLSSR4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本专利技术基于所述长林小蠹特异性引物，构建了长林小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.长林小蠹特异性引物，其特征在于，所述长林小蠹特异性引物包含CLSSF2和CLSSR4，所述CLSSF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CLSSR4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.用于检测长林小蠹的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1所述的长林小蠹特异性引物。3.根据权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包含样品基因提取试剂、2
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Taq Plus PCR MasterMix、无菌去离子水、阳性对照品中的至少一种。4.权利要求1所述特异性引物，或者权利要求2
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3任意一项所述的试剂或试剂盒在检测长林小蠹中的应用。5.检测长林小蠹的方法，其特征在于，使用权利要求1所述特异性引物，或者权利要求2
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3任意一项所述的试剂或试剂盒。6.根据权利要求5所述检测长林小蠹的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取待测样本的基因组DNA；S2、以所述待测样本的基因组DNA为模板，以所述CLSSF2和CLSSR4为引物，进行PCR扩增；S3、分析PCR扩增产物。7.根据权利要求6所述检测长林小蠹的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶静，钱铖，骆有庆，任利利，宗世祥，王建琳，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：