E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种E7多肽

【技术实现步骤摘要】
E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及牙周组织再生支架
，尤其是涉及一种E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]牙周炎是最常见的口腔疾病，牙周炎引起的牙周支持组织丧失是导致成年人牙齿缺失的最主要原因，严重影响了人们的生活质量，造成严重的疾病负担。
[0003]常规的牙周炎治疗方法是通过洗牙、牙根平整或翻瓣手术等手段，彻底清除局部牙菌斑、牙石等致病因素，消除炎症，最终达到延缓或阻止疾病进展的目的。但是，对于已经引起牙周缺损的牙周炎患者，常规治疗方法难以获得有效的牙周组织再生，牙周组织的支撑功能仍然受损，不利于疗效的长期稳定性。
[0004]临床治疗需要采用牙周再生技术来重建缺损的牙周结构并恢复其支持功能。牙周组织再生的主要细胞来源有四种：牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞、牙周膜干细胞和从附近的牙槽窝或血管动员的间充质干细胞。根据竞争性占位理论，在牙周缺损的自然愈合过程中，牙龈上皮细胞和成纤维细胞首先迁移至缺损区，并在缺损处牙根表面形成长结合上皮或纤维结缔组织附着，阻止牙周膜干细胞和间充质干细胞迁移到缺损处形成功能性牙周组织，从而无法重建缺失的牙周组织，如图1A所示。
[0005]引导组织再生（GTR）是目前临床实践中最常用的牙周组织再生技术，GTR技术应用屏障膜覆盖牙周缺损，以防止牙龈上皮细胞和成纤维细胞向牙周缺损区域内部生长，并为牙周膜干细胞和间充质干细胞的向内迁移提供封闭空间，如图1B所示。通过为牙周膜干细胞和间充质干细胞创造迁移、增殖和分化的时间和空间，GTR在部分临床病例中取得了积极的临床效果。然而，GTR屏障膜的应用有其自身的局限性。屏障膜根据生物降解性分为不可吸收膜和可吸收膜。其中不可吸收膜临床操作简易，具有足够的机械强度来维持牙周缺损的空间，但需要进行二次手术来移除膜片，给患者造成二次创伤，并且二次手术增加了局部感染的风险，易导致再生组织暴露，影响疗效。对于可吸收膜，虽然避免了二次手术，但是膜的力学性能较差，影响其维持空间的能力，容易塌陷移位，通常需要与植骨材料结合使用。尽管临床实践已采用各种措施努力克服上述缺点，但GTR的适应症非常有限，主要应用于窄而深的骨下袋缺损和下颌磨牙II类根分叉缺损；当牙周缺损较大或缺损形态欠佳时，往往无法获得有效的牙周再生，这严重阻碍了其临床应用。因此，探索稳定、有效的牙周组织再生技术，恢复牙周组织的生理性支撑功能，是牙周临床实践亟待攻克的难题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的牙周组织再生技术适应症有限，无法有效的恢复牙周组织的生理性支撑功能的技术问题。本专利技术提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架，所述支架包括明胶纳米纤维微球，所述E7多肽共轭结合至所述明胶纳米纤维微球的表面。第二方面，本专利技术提供了一种E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架的制备方法，包括如下步骤：（1）制备明胶纳米纤维微球；（2）制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸；将E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液；（3）将所制备的明胶纳米纤维微球用含有NaCl的PBS溶液清洗后浸入磺基琥珀酰亚胺
‑4‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
甲酸酯溶液中，在室温下搅拌，然后用含EDTA的PBS溶液洗涤处理后的明胶纳米纤维微球，将洗涤后的明胶纳米纤维微球加入到E7多肽溶液中进行反应，以得到E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架。根据一种优选实施方式，在步骤（3）中，还包括：用含有0.15M NaCl，pH7.2的0.1M PBS溶液清洗5mg的明胶纳米纤维微球；将清洗后的明胶纳米纤维微球浸入1ml磺基琥珀酰亚胺
‑4‑
（N
‑
马来酰亚胺甲基）环己烷
‑1‑
甲酸酯溶液中，在室温下轻轻搅拌1小时，用含0.1M EDTA的pH7.0的PBS溶液洗涤处理过的明胶纳米纤维微球；将上述明胶纳米纤维微球加入至1ml的E7多肽溶液中在室温下搅拌孵育1h；用蒸馏水清洗E7多肽共轭的明胶纳米纤维微球，冻干保存。
[0008]根据一种优选实施方式，所述的制备明胶纳米纤维微球的步骤，还包括：（1）准备工作：将异丙醇和乙醇置于
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80℃冰箱4h；将矿物油置于50℃预热1h；配置50%的乙醇溶液，备用；（2）将明胶溶解于上述步骤配置的50%的乙醇溶液中，加热至50℃，配置成12%的明胶溶液；（3）以800rmp转速搅拌矿物油，并将明胶溶液缓慢滴加进矿物油中，形成明胶/矿物油液滴；（4）将预冷的异丙醇、乙醇和室温二氧六环按照体积比为4：1：3比例配置成800ml混合有机溶剂，在低速搅拌状态下，将明胶/矿物油液滴乳化液倒入800ml预冷的有机溶剂中；通过低温相分离形成微球的纳米纤维结构；（5）待步骤（4）中的混合液恢复至室温，停止搅拌，将合成的明胶纳米纤维微球用20
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300μm的金属筛转移至长柱状玻璃容器；（6）配置交联催化剂：将1g 2
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吗啉乙磺酸、0.23g N
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羟基琥珀酰亚胺和0.38g 1
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（3
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二甲氨基丙基）
‑3‑
乙基碳二亚胺溶解于20ml去离子水；（7）取2ml所配置的交联催化剂加入到50ml丙酮中，配置成4%的交联剂；（8）将步骤（7）中的交联剂加入到装有明胶纳米纤维微球的长柱状玻璃容器中，在4℃低速搅拌状态下交联48h，以合成稳定的微球纳米纤维结构；（9）待交联完成后，用20
‑
300μm内多个不同尺寸的金属筛筛选出多种不同直径的微球，分装到15ml的离心管；（10）筛选后的不同直径的微球分别用乙醇和去离子水清洗；加入0.5 M的甘氨酸孵育3h，以中和未反应的交联剂；然后再分别用去离子水和乙醇清洗；（11）用二氧六环置换乙醇，在液氮中迅速冷冻，立即转移到真空低温冷冻干燥机，冷冻干燥；然后储存于密封袋，
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20℃保存备用。
[0009]根据一种优选实施方式，所述的制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸，将E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液的步骤，还包括：通过固相多肽合成法在E7多肽的羧基端引入一个半胱氨酸，其中所述E7多肽的氨基酸序列为EPLQLKM，所述E7多肽溶液的浓度为2mg/ml。第三方面，本专利技术提供了如第一方面所述的E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架在治疗牙周缺损中的应用。
[0010]基于上述技术方案，本专利技术的E7多肽
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明胶纳米纤维微球本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架，其特征在于，所述E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架包括明胶纳米纤维微球，E7多肽共轭结合至所述明胶纳米纤维微球的表面。2.一种E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备明胶纳米纤维微球；（2）制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸；将E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液；（3）将所制备的明胶纳米纤维微球用含有NaCl的PBS溶液清洗后浸入磺基琥珀酰亚胺
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(N
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马来酰亚胺甲基)环己烷
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甲酸酯溶液中，在室温下搅拌，然后用含EDTA的PBS溶液洗涤处理后的明胶纳米纤维微球，将洗涤后的明胶纳米纤维微球加入到E7多肽溶液中进行反应，以得到E7多肽
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明胶纳米纤维微球支架。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，还包括：用含有0.15M NaCl，pH7.2的0.1M PBS溶液清洗5mg的明胶纳米纤维微球；将清洗后的明胶纳米纤维微球浸入1ml磺基琥珀酰亚胺
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（N
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马来酰亚胺甲基）环己烷
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甲酸酯溶液中，在室温下轻轻搅拌1小时，用含0.1M EDTA的pH7.0的PBS溶液洗涤处理过的明胶纳米纤维微球；将上述明胶纳米纤维微球加入至1ml的E7多肽溶液中在室温下搅拌孵育1h；用蒸馏水清洗E7多肽共轭的明胶纳米纤维微球，冻干保存。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备明胶纳米纤维微球的步骤，还包括：（1）准备工作：将异丙醇和乙醇置于
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80℃冰箱4h；将矿物油置于50℃预热1h；配置50%的乙醇溶液，备用；（2）将明胶溶解于上述步骤配置的50%的乙醇溶液中，加热至50℃，配置成12%的明胶溶液；（3）以800rmp转速搅拌矿物...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡芝爱，戎鑫，邹淑娟，王骏，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：