本发明专利技术提供一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架及其制备方法，涉及再生医学与组织工程技术领域，其中制备方法包含以下步骤：将5mg/mL大鼠脱细胞脊髓溶液和0.5浓度的GelMA溶液混合，配置成用于3D打印的基质混合物；以基质混合物为生物墨水，针对脊髓外形及其内部神经传导束结构设计脊髓三维模型打印参数包括，打印层高为0.025mm，每层曝光时间0.5s，曝光亮度50％，总时长小于60秒，连续打印出带有纵向孔隙结构的圆柱形脊髓仿生水凝胶三维支架。本发明专利技术改善了大多数细胞可能会被炎症因子、氧自由基和溶酶体冲刷出循环并破坏的状况，应用我们构建的3D复合支架既可以有效规避这一问题，同时为损伤部位为受损神经的再生提供支持和引导的桥梁。经的再生提供支持和引导的桥梁。经的再生提供支持和引导的桥梁。
【技术实现步骤摘要】
一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架及其制备方法
[0001]本专利技术涉及再生医学与组织工程
，尤其涉及一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架及其制备方法。
技术介绍
[0002]脊髓损伤(SCI)是一种严重的致残性疾病，损伤后出现瘫痪、膀胱失控和自主神经功能丧失等症状，已成为一个特别棘手的问题。目前应用皮质类固醇药物消肿、手术缓解脊髓压力、康复训练预防疼痛、瘙痒、溃疡等并发症是脊髓损伤的主要治疗方法。不幸的是，中枢神经系统的自我修复能力非常有限。同时，这些传统的治疗方法并不能恢复受损脊髓的神经功能。
[0003]近年来，骨髓间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)被广泛用于脊髓损伤的治疗。宫血干细胞(MenSCs)是一种新型的间充质干细胞，我们的团队成功地应用于大鼠脊髓损伤的治疗。并已经证明其在改善大鼠的运动功能、减轻炎症反应、促进神经元分化、轴突再生方面的效果。然而，目前仍有许多局限性需要克服，特别是在使用细胞注射作为脊髓损伤的治疗策略方面。细胞移植后，大多数细胞可能会被炎症因子、氧自由基和溶酶体冲刷出循环并破坏。因此，如何保留移植后的干细胞并使其保持活性还有待进一步研究。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中如何保留移植后的干细胞并使其保持活性的技术问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：将5mg/mL大鼠脱细胞脊髓溶液和0.5浓度的GelMA溶液混合，配置成用于3D打印的基质混合物；
[0007]以基质混合物为生物墨水，应用SolidWorks2018三维制图软件，针对脊髓外形及其内部神经传导束结构设计脊髓三维模型打印参数包括，打印层高为0.025mm，每层曝光时间0.5s，曝光亮度50％，打印总时长小于60秒，连续打印出直径3mm，高度2mm，带有纵向孔隙结构的圆柱形脊髓仿生水凝胶三维支架。
[0008]优选的，所述大鼠脱细胞脊髓溶液和所述GelMA溶液按照3:7的体积比进行混合。
[0009]优选的，所述大鼠脱细胞脊髓溶液的制备包含以下步骤，
[0010]S1：大鼠脱细胞脊髓制备
[0011]a、取大鼠脊髓，PBS缓冲液清洗，去除表面血迹
[0012]b、脊髓置于
‑
80℃冻存1小时，室温解冻
[0013]c、脊髓置于蒸馏水内，室温浸泡6小时，每2小时换液一次
[0014]d、脊髓置于1％TritonX
‑
100/0.01MPBS溶液连续震荡3小时(4℃，100转/分)
[0015]e、蒸馏水震荡浸泡3小时，1小时换液1次
[0016]f、1％脱氧胆酸钠/0.01MPBS溶液持续震荡3小时(4℃，100转/分)
[0017]g、蒸馏水浸泡3小时，1小时换液1次
[0018]h、将脊髓脱细胞支架在冷冻干燥机中冻干至少24h；
[0019]S2：大鼠脱细胞脊髓溶液的制备
[0020]a、将冻干的脱细胞支架用液氮研磨粉碎成粉末状；
[0021]b、将粉末置于恒温摇床(25℃500rpm 6h)上用胃蛋白酶溶液(1mg胃蛋白酶溶于1ml0.1MHCl)溶解12h；5mg粉末溶于1mL胃蛋白酶溶液；配置成5mg/mL的大鼠脱细胞脊髓溶液。
[0022]优选的，所述GelMA水凝胶的制备方法如下：
[0023]a.配制0.25％(w/v)光引发剂溶液；
[0024](1)取20ml无菌1X PBS，加至装有0.05g光引发剂的棕色瓶子；
[0025](2)以40
‑
50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次；
[0026]b.配制GelMA溶液
[0027](1)取0.1g的GelMA放入离心管；
[0028](2)取2ml引发剂标准溶液加入到上述离心管中，振荡使GelMA充分浸润；
[0029](3)以60
‑
70℃水浴避光加热溶解15分钟，期间振荡数次获得GelMA溶液。
[0030]优选的，获得GelMA溶液后立即用0.22um无菌针头过滤器灭菌。
[0031]本申请还提供了一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架，使用上述所述的制备方法制备得到。
[0032]本专利技术为脊髓损伤的治疗提供一种新的策略。改善大多数细胞可能会被炎症因子、氧自由基和溶酶体冲刷出循环并破坏的状况，应用我们构建的3D复合支架既可以有效规避这一问题，同时为损伤部位为受损神经的再生提供支持和引导的桥梁。
附图说明
[0033]图1为本专利技术一实施方式中3D打印脱细胞脊髓与GelMA复合支架外观图；
[0034]图2为本专利技术一实施方式中3D打印脱细胞脊髓与GelMA复合支架在光学显微镜的镜下观的图；
[0035]图3为本专利技术一实施方式中3D打印脱细胞脊髓与GelMA复合支架的扫描电镜的图；
[0036]图4为本专利技术一实施方式中种植于3D打印脱细胞脊髓与GelMA复合支架中宫血干细胞活死染色结果图；
[0037]图5为本专利技术一实施方式中种植于3D打印脱细胞脊髓与GelMA复合支架中鬼笔环肽染色结果图。
[0038]图6为本专利技术一实施方式中将3D打印复合支架植入大鼠脊髓损伤断端改善大鼠运动功能的结果图。
具体实施方式
[0039]以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步地详细说明。
[0040]一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架的制备方法，包含以下步骤：
[0041]S1：大鼠脱细胞脊髓制备；
[0042]具体的，在一实施方式中，包含以下步骤：
[0043]1、取大鼠脊髓，PBS缓冲液清洗，去除表面血迹；
[0044]2、脊髓置于
‑
80℃冻存1小时，室温解冻；
[0045]3、脊髓置于蒸馏水内，室温浸泡6小时，每2小时换液一次；
[0046]4、脊髓置于1％TritonX
‑
100/0.01M PBS溶液连续震荡3小时(4℃，100转/分)；
[0047]5、蒸馏水震荡浸泡3小时，1小时换液1次；
[0048]6、1％脱氧胆酸钠/0.01M PBS溶液持续震荡3小时(4℃，100转/分)；
[0049]7、蒸馏水浸泡3小时，1小时换液1次；
[0050]8、将脊髓脱细胞支架在冷冻干燥机中冻干至少24h。
[0051]S2：大鼠脱细胞脊髓溶液的制备；
[0052]具体的，在一实施方式中，包含以下步骤：
[0053]1、将冻干的脱细胞支架用液氮研磨粉碎成粉末状。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种促进脊髓损伤的脱细胞脊髓/GelMA水凝胶复合3D打印支架的制备方法，其特征在于：将5mg/mL大鼠脱细胞脊髓溶液和0.5浓度的GelMA溶液混合，配置成用于3D打印的基质混合物；以基质混合物为生物墨水，应用SolidWorks2018三维制图软件，针对脊髓外形及其内部神经传导束结构设计脊髓三维模型打印参数包括，打印层高为0.025mm，每层曝光时间0.5s，曝光亮度50％，打印总时长小于60秒，连续打印出直径3mm，高度2mm，带有纵向孔隙结构的圆柱形脊髓仿生水凝胶三维支架。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述大鼠脱细胞脊髓溶液和所述GelMA溶液按照3:7的体积比进行混合。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述大鼠脱细胞脊髓溶液的制备包含以下步骤，S1：大鼠脱细胞脊髓制备a、取大鼠脊髓，PBS缓冲液清洗，去除表面血迹b、脊髓置于
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80℃冻存1小时，室温解冻c、脊髓置于蒸馏水内，室温浸泡6小时，每2小时换液一次d、脊髓置于1％TritonX
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100/0.01MPBS溶液连续震荡3小时(4℃，100转/分)e、蒸馏水震荡浸泡3小时，1小时换液1次f、1％脱氧胆酸钠/0.01MPBS溶液持续震荡3小时(4℃，100转/分)g、蒸馏水浸...
【专利技术属性】
技术研发人员：居丁玥，董传明，喻姝敏，王庆华，刘晋宜，张璇璇，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：
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