软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法，属于组织工程领域。本发明专利技术的软骨细胞外基质微胶囊包括芯材与包裹于芯材外的壁材；所述壁材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，所述壁材为壳聚糖；所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01

【技术实现步骤摘要】
软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法


[0001]本专利技术属于组织工程领域，具体涉及一种软骨细胞外基质微胶囊、组织工程支架及它们的制备方法。

技术介绍

[0002]关节软骨是一种富含Ⅱ型胶原和糖胺多糖的透明软骨，在关节活动中起到承载机械负荷与润滑关节的作用。与其他组织不同，软骨组织中没有血管、神经，其退变和损伤后的自生修复能力极其有限，损伤达到3mm后就很难修复，而损伤达到6mm后，就会对下骨造成伤害。目前，治疗关节软骨损伤的手术方法主要有微骨折、自体软骨细胞植入(ACI)、镶嵌成形术和同种异体软骨移植等方法。但这几种方法都存在一定的局限性，不能完全恢复自体原始软骨，而且预后具有不确定性，基于此，植入合适的组织工程支架便为解决这一问题提供了更好的解决办法。
[0003]软骨组织工程是在一些利于细胞分化和增殖的因子参与下，体外培养和扩增软骨种子细胞，把一定量的种子细胞培养在生物材料支架上，然后移植到软骨缺损部位，形成新的软骨组织，经过重塑形，并与机体组织整合在一起，达到损伤软骨的再生修复。软骨组织工程的内容主要是三个方面：种子细胞、生物材料支架、生长因子，其中，生物材料支架作为细胞外基质的临时替代物，为工程化软骨组织提供三维几何形状，并为种子细胞提供生存的微环境，为细胞的粘附、增殖、分化并最终形成新的软骨组织基本框架和代谢场所，是软骨组织工程成功的关键。
[0004]目前应用于生物支架的材料主要包括天然和合成两种，人工合成多聚体有聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸复合物、聚乙烯醇等，天然聚合物有软骨细胞外基质、琼脂糖、明胶、透明质酸等。其中，软骨细胞外基质因其良好的生物安全性和生物相容性以及细胞识别及粘附的位点而广泛的用于组织工程支架材料。
[0005]现有的组织工程支架只是被动的为细胞提供生存的微环境，而且性能相对比较差，不能很好的促进软骨的再生分化。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的第一个目的，是提出一种软骨细胞外基质微胶囊，其具有缓释功能，为软骨种子细胞长时间提供营养，维持软骨种子细胞在软骨缺损部位生长，达到损伤软骨的再生修复。
[0007]本专利技术的第二个目的，是提出上述软骨细胞外基质微胶囊的制备方法。
[0008]本专利技术的第三个目的，是提出一种软骨细胞外基质组织工程支架，该支架具有优异的力学性能，高吸水、高孔径，没有生物毒性，不仅为细胞提供生存的微环境，还可以持续促进BMSC分化增殖为软骨细胞，促进软骨的再生修复。
[0009]本专利技术的第四个目的，是提出上述软骨细胞外基质组织工程支架的制备方法。
[0010]本专利技术的一种软骨细胞外基质微胶囊，包括芯材与包裹于芯材外的壁材；所述壁
材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，更优选为1:(1～2.5)，再优选为1:(1.2～2)，最优选为1：(1.4～1.6)。
[0011]本专利技术提供的软骨细胞外基质微胶囊的壁材为壳聚糖；所述壳聚糖脱乙酰度≥90％，分子量20
‑
40w；
[0012]所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01
‑
0.03):(1～10):(1～6)：(1～4):(2～6)；最优选为0.02:6:3:2:3。
[0013]本专利技术的芯材中生长因子包括TPF
‑
β1和/或BMP
‑
4，优选地，生长因子包括TPF
‑
β1和BMP
‑
4，两者按质量比为1:1进行复配；本专利技术中采用TPF
‑
β1与BMP
‑
4两种生长因子复配的方式，用以提高支架对于软骨损伤的修复，其中TPF
‑
β1可以促进骨髓间充质干细胞的Sox
‑
9基因表达以及软骨细胞外基质的合成，并可以促进软骨细胞的新陈代谢；BMP
‑
4可以增大细胞外基质的产出量，抑制细胞肥大，促进干细胞向软骨分化；但是生产因子很容易失活，因此需要载体将生长因子储存缓慢释放，提高生长因子的作用时间；细胞外基质的超微机构是TPF
‑
β1、BMP
‑
4等生长因子天然的优良载体，使用细胞外基质作为生长因子的吸附剂，可以有效延长生长因子的存活时。
[0014]所述吸附剂为软骨细胞外基质，优选地，所述软骨细胞外基质的粒径为800
‑
1200目。
[0015]优选地，本专利技术的软骨细胞外基质来源于牛，该软骨细胞外基质制备方法包括以下步骤：
[0016]S1.取牛膝盖骨在无菌条件下打开腔体，使用手术刀将软骨剔出，不要剔到软骨下骨；
[0017]S2.使用PBS浸泡清洗，除去软骨表面的血水及杂物；
[0018]S3.采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡灭活，料液比为1:5
‑
1:10，m/V，于4℃条件下浸泡24
‑
48h；
[0019]S4.将软骨放入液氮中冷冻，然后进行研磨，冷冻时间2
‑
4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1
‑
2min；
[0020]S5.去脂、去细胞膜，加入脱脂液，料液比为1:3
‑
1:5，m/V在37℃恒温振荡48H，每12h换一次液，所述脱脂液配比如下：
[0021]3‑
8份碳酸钠、0.1
‑
0.5份EDTA
‑
4Na、1
‑
3份碳酸氢钠、0.5
‑
1份SDS、0.5
‑
1份triton x
‑
100、3
‑
5份异丙醇、0.1
‑
0.3份AEBSF、82.2
‑
92.8份纯化水。
[0022]所述脱脂液采用弱碱性的碳酸钠加碳酸氢钠组合脱脂，可以有效剥离软骨组织中的脂类，而且相对温和，加入的SDS与triton x
‑
100可以改变细胞膜通透性，从而使细胞破裂，而且还可以增大脂类的溶解性，与此同时，本专利技术中采用EDTA
‑
4Na作为重金属清除剂，可以有效降低所得到的细胞外基质中的重金属含量，保证细胞外基质的生物安全性。
[0023]S6.DNA酶、RNA酶消化，采用消化酶混合液处理去细胞的软骨组织，料液比为1:1
‑
1:2，m/V，所述消化酶混合液包含50
‑
100U/ml DNase，0.5
‑
2U/ml RNase，置于恒温摇床内37℃消化12
‑
24小时，震荡频率100
‑
180rpm；
[0024]S7.将去细胞后的软骨组织反复水洗，冷冻干燥，得到软骨细胞外基质固体；
[0025]S8.将软骨细胞外基质固体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，包括芯材与包裹于芯材外的壁材；所述壁材与芯材的质量比优选为1:(1～3)，更优选为1:(1～2.5)，再优选为1:(1.2～2)，最优选为1：(1.4～1.6)；所述壁材为壳聚糖；所述芯材包括生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油；所述生长因子、吸附剂、乳化剂、分散剂与基础油的质量比为(0.01
‑
0.03):(1～10):(1～6):(1～4):(2～6)；最优选为0.02:6:3:2:3。2.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，所述芯材中生长因子包括TPF
‑
β1和/或BMP
‑
4，优选地，生长因子包括TPF
‑
β1和BMP
‑
4，两者按质量比为1:1进行复配。3.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，所述吸附剂为牛的软骨细胞外基质，该软骨细胞外基质的制备方法包括以下步骤：S1.取牛膝盖骨在无菌条件下打开腔体，使用手术刀将软骨剔出；S2.使用PBS浸泡清洗，除去软骨表面的血水及杂物；S3.采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡灭活，料液比为1:5
‑
1:10，m/V，于4℃条件下浸泡24
‑
48h；S4.将软骨放入液氮中冷冻，然后进行研磨，冷冻时间2
‑
4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1
‑
2min；S5.去脂、去细胞膜，加入脱脂液，料液比为1:3
‑
1:5，m/V在37℃恒温振荡48H，每12h换一次液，所述脱脂液配比如下：3
‑
8份碳酸钠、0.1
‑
0.5份EDTA
‑
4Na、1
‑
3份碳酸氢钠、0.5
‑
1份SDS、0.5
‑
1份triton x
‑
100、3
‑
5份异丙醇、0.1
‑
0.3份AEBSF、82.2
‑
92.8份纯化水；S6.DNA酶、RNA酶消化，采用消化酶混合液处理去细胞的软骨组织，料液比为1:1
‑
1:2，m/V，所述消化酶混合液包含50
‑
100U/ml DNase，0.5
‑
2U/ml RNase，置于恒温摇床内37℃消化12
‑
24小时，震荡频率100
‑
180rpm；S7.将去细胞后的软骨组织反复水洗，冷冻干燥，得到软骨细胞外基质固体；S8.将软骨细胞外基质固体液氮冷冻后研磨，冷冻时间2
‑
4min，研磨工艺为1500转/min，研磨时间1
‑
2min，待软骨细胞外基质恢复到室温后，在50℃恒温干燥箱中，放置0.5
‑
1h，先过800目筛，取筛下粉末，再过1200目筛，取筛上粉末，重复上述操作3
‑
5次，最终得到软骨细胞外基质粉末。4.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊，其特征在于，所述乳化剂为司盘80和/或司盘20；所述基础油为甜杏仁油；所述分散剂优选为聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的醇解度优选为98％～100％；所述聚乙烯醇的粘度优选为5
‑
6mPa.s；所述聚乙烯醇优选挥发分≤5.0，纯度≥93.5，灰分≤0.7；所述聚乙烯醇的pH值优选为5～7。5.如权利要求1所述的软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、芯材溶液制备：依次将生长因子、吸附剂在PBS中混合，得到芯材PBS溶液；S2、油相制备：将乳化剂、分散剂与甜杏仁油混合加热，得到油相；S3、壁材溶液制备：将壳聚糖加入到0.1mol/L的乙酸水溶液中，充分溶解过滤，得到壁
材溶液；S4、将芯材水溶液与壁材溶液混合搅拌，加入油相继续搅拌，得到软骨细胞外基质微胶囊溶液；S5、将所述软骨细胞外基质微胶囊溶液经喷雾干燥后，得到所需的软骨细胞外基质微胶囊。6.如权利要求5所述的软骨细胞外基质微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体操作过程如下：首先将生长因子加入到PBS中搅拌，此过程中搅拌的转速优选为500～800转/min，搅拌的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，再优选为20min；然后缓慢加入吸附剂搅拌，此过程中搅拌的转速优选为100～300转/min...

【专利技术属性】
技术研发人员：应慧春，王世坤，韩菲，曾胜，
申请(专利权)人：海南苏生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：